阐明一种新型光响应蛋白日光视紫红质的结构

Wataru Shihoya（东京大学研究生院生物科学系、日本学术振兴会研究员）
Keiichi Inoue（东京大学固体物理研究所副教授）
Yuji Furuya（V体育光生物技术研究中心副教授）^＊
内桥孝之（名古屋大学研究生院教授、国立自然科学研究所/生命创造探索中心客座教授）
Hideki Kandori（V体育光生物技术研究中心教授）
Osamu Nureki（东京大学研究生院研究生院生物科学系教授）
*截至去年，美国国立自然科学院分子科学研究所副教授

　　
◆我们确定了日光视紫红质的三维结构，这是一种新型光转导分子，其氨基酸序列与已知视紫红质显着不同。从它们的三维结构中，他们发现两者的基本结构实际上是相同的，尽管它们的氨基酸序列不同。然而，结合细胞生化分析的结果，已经清楚，与正常视紫红质相比，日光视紫红质在膜内具有相反方向的结构。

◆日光视紫红质的细胞外部分被疏水性氨基酸封闭，离子和其他物质被认为无法通过。另一方面，视网膜上方有一个水平孔，这对于有效摄取视网膜非常重要。
◆这项研究将有助于今后分析日光视紫红质的生理作用，并将加深我们对不受氨基酸序列限制的“视紫红质多样性”的理解。

　视紫红质（注1）是一种光响应蛋白，存在于从细菌到人类的许多生物体内，并具有多种功能。 2018年发现的日光视紫红质（Heliorhodopsin），其氨基酸序列与现有的这些视紫红质显着不同，并且其在膜内的方向是相反的，因此推测它在光学信息传输中发挥作用。此次，由日本学术振兴会研究员志保谷涉、东京大学研究生院理科研究科V体育教授努雷木修教授、神户英树教授领导的研究小组利用X射线晶体学测定了日光视紫红质的三维结构。晶体结构表明，由于不同氨基酸的组合，日光视紫红质可以经历与细菌视紫红质类似的光诱导结构变化。本研究结果将阐明日光视紫红质的结构和功能，有助于探索视紫红质的多样性和新型视紫红质。
　这项研究是日本科学技术振兴机构（JST）战略创意研究促进计划（CREST）研究领域“利用光的特性的生物功能时空控制技术的开发和应用”（研究主管：影山龙一郎）研究课题“细胞内第二信使的光学操纵的开发和应用”（研究代表：神取秀树）的一部分进行的。

　视紫红质是负责人眼视觉的膜蛋白之一，负责识别光并将信号传输到视神经的初始反应。视网膜（注2）是结合在蛋白质内部的维生素A衍生物色素，因光而发生结构变化，使蛋白质的结构发生移动，从而激活作为信号传递分子的三聚体G蛋白（注3）。视紫红质也存在于细菌等微生物中，其中许多微生物利用光将离子传输进出细胞。近年来，开发了一种称为光遗传学（光遗传学，注4）的新技术，其中微生物视紫红质在动物大脑神经元中表达，并通过利用光控制神经兴奋和抑制来控制动物的行为，视紫红质家族从基础和应用角度都引起了人们的关注。
　2018 年，人们发现了日光视紫红质，其氨基酸序列与之前的视紫红质显着不同（图 1）。在古细菌、真细菌、藻类等真核生物和巨型病毒中已发现了超过500种类型的日光视紫红质，使其成为第三类视紫红质。与典型的微生物视紫红质细菌视紫红质（注5）一样，日光视紫红质具有视网膜色素，但不具有微生物视紫红质特有的离子传输特性。此外，由于光反应周期缓慢，推测日光视紫红质通过未知的信息转导分子（例如三聚体G蛋白）参与光转导。
　据预测，日光视紫红质具有与源自微生物的视紫红质类似的七次跨膜结构，但其相对于膜的方向预计是相反的，这使得它是否真的具有相同的三维结构或新的结构成为一个完全的谜。此外，许多拥有日光视紫质的物种不具有视网膜生物合成系统，并且推测它们通过摄取环境中存在的视网膜而发挥功能，但其机制尚不清楚。

　这一结果是通过从Kandori小组接收基因并由东京大学Nureki小组进行结构分析而获得的，从而成功地分析了来自嗜酸菌的日光视紫红质的X射线晶体结构（注6）。随后，我们与生物物理分析专家古谷副教授和内桥教授进行了联合研究，详细阐明了日光视紫质的结构与功能之间的关系。
　日光视紫红质的跨膜区结构与细菌视紫红质的跨膜区结构相似，并且已揭示尽管序列同源性较低，但两者具有共同的结构（图2）。此外，我们发现视网膜以类似于细菌视紫红质的方式与赖氨酸共价结合。另一方面，胞外环具有延伸的片状结构，在晶体结构中，它通过覆盖邻近的分子形成致密的二聚体。高速原子力显微镜（AFM）观察（注7）证实，即使在生理条件下，脂质双层膜中也能维持这种二聚体，表明日光视紫红质基本上以二聚体的形式发挥作用（图3）。
此外，通过在细胞中表达的日光视紫红质的N端和C端附加不同的荧光标签，我们进行了单细胞成像，结果发现日光视紫红质确实具有与正常视紫红质相反的膜拓扑结构（图1）。
　日光视紫红质的细胞外部充满疏水性氨基酸残基，没有间隙供离子或底物通过（图4）。这些氨基酸残基在日光视紫红质中高度保守，表明所有日光视紫红质不能像微生物视紫红质那样充当转运蛋白。另一方面，在细胞内部，从视网膜到细胞内环，存在由水分子介导的广泛的亲水相互作用，这被认为对于与光接收相关的日光视紫红质的结构变化很重要。此外，时间分辨红外光谱显示，长寿命 O 中间体的特征结构变化持续超过 1 秒。

　日光视紫红质的结构在视网膜上方有一个大的水平孔，这在以前的视紫红质中是没有见过的（图5）。当日光视紫红质发生突变来封闭这个孔时，视网膜重建效率大大降低。因此，这个侧孔被认为对于日光视紫红质有效地从环境中摄取视网膜非常重要。

　在这项研究中，我们确定了日光视紫红质的三维结构。尽管日光视紫红质与细菌视紫红质的氨基酸序列显着不同，甚至其朝向膜的方向也相反，但在结构和视网膜结合模式上有许多相似之处。然而，由于它缺乏离子传输能力，因此很可能存在涉及日光视紫红质的新型光信号转导系统，并且期待未来的研究。这些相似性还表明视紫红质可能在环境中大量存在而不受序列限制。预计通过使用该结构信息的序列分析将发现更多新的视紫红质。

杂志名称：《自然》（网络版）
论文标题：日光视紫红质的晶体结构
作者：志保谷涉¹，井上敬一^2-5，曼尼什·辛格²，绀野正江²，细岛能子²，山下庆太郎^{1, 6}，池田贤人⁷，樋口翔子¹，冈崎佐江¹，玉木泉¹，桥本正则²，水鸟律²，富田佐穗子²，山内梦子²，吉住丽²，片山浩大^{2, 3}，角田聪^{2, 5}，柴田干宏^{8, 9}，古谷雄二^{2, 10, 11}，阿丽娜·普什卡列夫¹²，奥德·贝贾¹²，内桥孝之^{13, 14}，神鸟英树^{2, 3}*，努雷木修¹*
*共同通讯作者 1 东京大学理学院生物科学系 2 V体育工学研究科生命与应用化学系 3 V体育光生物技术研究中心 4 东京大学固体物理研究所(5)急速6 RIKEN SPring-8 7 金泽大学自然科学技术研究生院数理科学系 8 金泽大学纳米生命科学研究所 9 金泽大学先端科学研究所高速生物 AFM 应用研究所 10 自然科学研究所分子科学研究所生命与配位分子科学研究领域 11 结构系分子科学研究生院高等研究科 12 以色列理工学院 13 名古屋大学研究生院材料科学研究科 14 国立自然科学研究所生命创造探索中心
DOI编号：101038/s41586-019-1604-6
摘要网址：

东京大学科学研究生院生物科学系
Osamu Nureki 教授
电话:03-5841-4394E-mail:nureki[at]bssu-tokyoacjp

V体育光生物技术研究中心
神取英树教授
电话:052-735-5207【邮箱:kandori[at]nitechacjp

东京大学理学院研究生院
特聘专家竹田加奈子、公共关系办公室主任大越真一教授
电话:03-5841-0654【邮箱:kouhous[at]gsmailu-tokyoacjp

V体育企划公关科
电话: 052-735-5647【邮箱:pr[at]admnitechacjp

名古屋大学总务部、总务部、公关室
电话: 052-789-2699【邮箱:nu_research[at]admnagoya-uacjp

东京大学固体物理研究所公共关系办公室
电话:04-7136-3207E-mail:按[at]isspu-tokyoacjp

公共关系办公室、研究强化战略办公室、国立自然科学院、分子科学研究所
电话:0564-55-7209E-mail:按[at]imsacjp

国立自然科学研究院生命创造研究中心公共关系官员
电话:0564-59-5201【邮箱:按[at]excellsorionacjp

日本科学技术振兴机构公关部
电话:03-5214-8404【邮箱:jstkoho[at]jstgojp

日本科学技术振兴机构战略研究推进部生命创新小组
川口哲
电话:03-3512-3524【电子邮箱:冠[在]jstgojp

*请将每个 [at] 替换为 @。

（注1）视紫红质：
与视网膜结合作为辅助因子的7-跨膜蛋白。根据一级结构的不同，分为微生物视紫质和动物视紫质。微生物视紫质已在真核生物、真细菌和古细菌中被发现，并且视紫质具有多种功能，例如响应光传输离子和将信号传输到细胞中。

（注2）视网膜：
可以通过吸收光使物质着色的官能团称为发色团。在视紫红质中，一种称为视黄醛的维生素 A 衍生物充当发色团。在许多生物体中，这种发色团（视网膜）与视紫红质蛋白的赖氨酸残基结合。当它吸收光时，它会改变其结构并参与包括视觉在内的各种现象。

（注3）三聚体G蛋白：
一种参与细胞内信号转导的 GTP 结合蛋白，由具有七次跨膜螺旋结构的受体蛋白（例如视紫红质）激活。受体统称为GTP结合蛋白偶联受体（GPCR），不仅涉及视觉等感官，还涉及神经递质和激素等信息传递，是药物发现的重要靶点。

（注4）光遗传学：
这是一个结合了光学和遗传学的新词，由其创始人 Deisseroth 博士命名。在 2005 年进行的第一个实验中，他们在神经细胞中表达微生物通道视紫红质，并用光刺激神经来控制动物行为。它有望成为阐明大脑功能的新方法。光遗传学一词现在广泛用于使用光来控制和操纵生物体活动的方法。

（注5）细菌视紫红质：
一种典型的微生物视紫红质。存在于高度嗜盐细菌细胞膜中的一种膜蛋白，由于含有发色团视网膜，因此呈紫色。它作为光驱动质子泵发挥能量转换功能。最早阐明其三维结构的膜蛋白之一。

(注6)X射线晶体结构分析：
当X射线照射到蛋白质规则排列的晶体上时，可以获得衍射图像。一种通过分析蛋白质衍射图像来阐明蛋白质结构的实验方法。组成蛋白质的各个原子的位置是可以确定的。

（注7）高速原子力显微镜（AFM）：
一种显微镜，通过用连接到软板簧尖端的针尖接触样品来可视化样品的表面形状。通过在改变针与样品的水平相对位置的同时测量样品表面的高度来可视化样品的表面形状。通过高速（高达 16 帧/秒）扫描样品表面，可以将样品的运动可视化。

微生物视紫红质和动物视紫红质的N端面向细胞外部，而日光视紫红质具有N端面向细胞内部的特性。

图2 日光视紫红质的整体结构

左边是晶体中的二聚体结构。右图是与细菌视紫红质结构的叠加。

图 3 使用高速 AFM 观察脂质膜内的日光视紫质

高速 AFM 观察脂质中嵌入的日光视紫红质。可以观察到与晶体结构相似的二聚体。

图4 日光视紫红质的分子内相互作用

左图显示了分子内部的氨基酸列表。右图是空间填充模型的横截面，可以看出单元内部和外部都是封闭的。

图 5 意外发现的日光视紫红质孔

视网膜紫罗兰酮环顶部有一个大孔。这是因为其正上方的氨基酸残基是甘氨酸，没有侧链。在使用羟胺解离纯化的日光视紫红质的视网膜然后重建的实验中，在突变体G171W中，视网膜根本没有重建，其堵塞了侧孔。