视紫红质中新的波长控制残基的发现~阐明波长控制机制以及光遗传学应用的展望~

演示要点

〇〇基于对八种新酶视紫红质的综合表征，我们鉴定出了一种以前未报道过的新的波长控制残基，并通过突变体分析阐明了其波长控制机制。
〇〇这一机制被证明适用于所有微生物视紫红质，它们有很多家族。
〇​有望应用于光遗传学所需的波长控制工具的开发。

摘要

　由V体育工程研究生院生命科学与应用化学系三年级学生Masahiro Sugiura、特聘助理教授Manish Singh和特聘教授Hideki Kandori领导的研究小组在微生物视紫红质中发现了一种新的波长控制残留物。
　视紫红质内结合有一种称为视黄醛（维生素 A 的类似物）的分子来吸收光，但其吸收波长根据蛋白质内部的环境而变化很大。如果我们能够自由控制吸收波长，我们就可以为利用光控制生命活动的光遗传学做出巨大贡献。当两种天然存在的视紫红质在同一位点具有不同的氨基酸时，吸收波长通过取代向相反方向移动的位点称为“颜色开关”。视网膜周围有20多个氨基酸，但蛋白质的结构非常精确，更换氨基酸很容易破坏结构，迄今为止只发现了三种“颜色开关”。
　该研究小组发现了自然界的第四种“颜色开关”。具体来说，基于对新酶视紫红质的分析，我们揭示了 N/LI 开关的存在。在 N/LI 开关中，天冬酰胺 (N) 残基在红色方向吸收，亮氨酸 (L) 或异亮氨酸 (I) 残基在蓝色方向吸收，突变会反转吸收波长。该机制可以通过氨基酸的极性来解释。此外，我们还发现 N/LI 开关适用于所有微生物视紫红质。新发现的N/LI开关有望应用于光遗传学。
　该研究成果发表在美国化学会杂志《'' 杂志（2023 年 7 月4 日期)。

研究背景

　动物和微生物视紫红质吸收 400 至 700 nm 宽光谱范围内的电磁波。该区域称为可见光，由彩虹的颜色组成：紫色、靛蓝、蓝色、绿色、黄色、橙色和红色。我们的眼睛可以区分这些颜色，但我们用来吸收光的唯一分子是一种称为视网膜的发色团。这表明视网膜的吸收波长受到称为视紫红质的蛋白质的严格控制，该蛋白质识别各种光（颜色），例如紫罗兰色、靛蓝、蓝色、绿色、黄色、橙色和红色。
视紫质吸收最大波长(λ_最大) 是视网膜的电子基态 (S₀) 和第一激发态 (S₁)（图1）。如果我们吸收与该能量差相对应的光，S₀来自 S₁状态并且分子开始发挥作用。 S₀状态下，视网膜发色团的正电荷位于席夫碱键（氮原子处），但 S₁状态下，它向β-紫罗兰酮环离域（图1a，右）。此时，已知能隙的大小会根据视网膜附近存在的电荷而变化，这控制着视紫红质的吸收波长（图1a，左）。具体来说，当席夫碱附近有负电荷时，S₀因为状态稳定，S₀-S₁之间的能隙变大（图1b）。在可见光中，越接近紫色（400 nm），能量越高，因此在这种情况下，吸收波长会向较短的波长移动。反之，如果β-紫罗兰酮环附近有负电荷，则S₁因为状态稳定，S₀-S₁之间的能隙变得更小，吸收波长移动到更长的波长（更接近红色）（图1c）。事实上，人类的红色（λ_最大: 560 nm) 和绿色 (λ_最大：530 nm）的颜色辨别是通过β-紫罗兰酮环附近具有三个O-H基团（带弱负电荷）的氨基酸残基实现的。该规则通常适用于所有视紫红质。

图1 视紫红质吸收波长调节原理

　

　如果按照这个规则创建突变体，似乎可以轻松控制吸收波长，但蛋白质是经过精确设计的，添加突变很容易破坏蛋白质与视网膜之间的相互作用。因此，到目前为止，只有三个波长可控的残基被认为是“颜色开关”（亮氨酸/谷氨酰胺/丙氨酸/丝氨酸/苏氨酸/甘氨酸/脯氨酸的单氨基酸突变开关）(图 2)。

图2 现有波长控制残基（L/Q、A/TS、G/P)和新发现的波长控制残基(N/LI）

研究内容/结果

　本课题组前期报道的新型酶视紫红质的研究中，发现了与上述三种不同的新的候选波长控制残基（图2）。氨基酸残基为天冬酰胺（极性残基）和亮氨酸/异亮氨酸（非极性残基），且位于β-紫罗兰酮环附近，因此根据上述规则，S₁预计会影响该州。因此，通过在视紫红质磷酸二酯酶中添加单个氨基酸突变，我们测量了天冬酰胺和亮氨酸对视紫红质吸收波长的影响。在某些情况下，蛋白质变得不稳定并被破坏，但从亮氨酸到天冬酰胺的突变导致了更长的吸收波长，而从天冬酰胺到亮氨酸/异亮氨酸的突变导致了更短的吸收波长，这表明该区域的氨基酸残基充当了控制吸收波长的“颜色开关”。
　这个机制可以用上面提到的波长调节原理很好地解释。亮氨酸残基具有非极性侧链，因此不会与视网膜分子发生静电相互作用，而天冬酰胺残基具有位于视网膜β-紫罗兰酮环附近的δ-带负电的氧原子，导致S₁稳定后，能隙减小，吸收波长变长（图3）。

图3 天冬酰胺和亮氨酸残基的波长控制机制

　

　接下来，我们研究了这种“颜色转换”是否不仅适用于视紫红质磷酸二酯酶家族，而且也适用于所有使用突变体的微生物视紫红质。作为微生物视紫红质的代表，我们使用了向内氯泵（FR）、向外钠泵（KR2）、向内质子泵（PoXeR）和最近发现的日光视紫红质（TaHeR）。结果，他们发现这种残留物在所有这些微生物视紫红质中起着“颜色开关”的作用。

社会意义/未来展望

　人们第一次看到视紫红质的印象大多与颜色有关，比如“这颜色真漂亮”，研究人员也进行了类似的长期研究，以澄清吸收波长是如何控制的问题。然而，目前视紫红质的颜色在实际表达之前还无法确定。未来，如果能够根据氨基酸序列来确定视紫红质的颜色，预计这将引发各个领域的研究。作为控制吸收波长的“颜色开关”的氨基酸残基的发现在视紫红质研究领域具有重要意义。
　自2005年光遗传学诞生以来，细菌视紫红质就一直受到人们的关注。光遗传学是利用遗传学在靶细胞中表达感光蛋白并利用光来控制生物活动的研究领域，目前正被应用于神经生理学和基因治疗等广泛的研究领域。
　为了用光控制生物反应，需要改变吸收波长。例如，如果可以使用不同类型的光来控制功能的激活和失活，它将成为一种更易于使用的工具。由于红色更容易通过生物体传播，就像我们把手举到太阳时看到红色一样，可以被红光激活的视紫红质将能够操纵体内更深处的光。
　因此，我们使用遗传分析软件来确认与我们发现的波长控制残基相同位置的氨基酸在整个微生物视紫红质中具有什么特性（图 4）。除视紫红质磷酸二酯酶和一些日光视紫红质外，几乎所有视紫红质的疏水性氨基酸残基都是保守的。这项研究揭示，通过将亮氨酸和异亮氨酸等非极性氨基酸残基突变为天冬酰胺残基，有望创建具有更长吸收波长的光遗传学工具。

图4. 微生物视紫红质中新型波长控制残基位置的氨基酸保守

　

　这项研究不仅限于视紫红质研究领域，而是提供了可以直接应用于光遗传学的知识，目前光遗传学正在进行快速研究，并有望扩大未来的研究。

　这项研究成果得到了日本学术振兴会特别研究员补助金、科学研究补助金（特别促进研究）和日本科学技术振兴机构（CREST“利用光特性的生命功能时空控制技术的开发和应用”）的支持。

论文信息

论文标题：微生物视紫红质的新型颜色开关
作者姓名：Masahiro Sugiura、Manish Singh、Satoshi P Tsunoda、Hideki Kandori
出版杂志名称：Biochemistry
发布日期：2023 年 7 月 4 日（美国时间）
DOI（数字对象标识符）：101021/acsbiochem3c00131
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