阐明微生物响应光转运钾V体育官网的机制及其在神经科学中的应用 - 四分之一个世纪以来首次发现钾V体育官网选择性的全新机制 -

东京大学
V体育

演示要点

◆响应光选择性转运钾V体育官网的蛋白质（钾通道视紫红质：钾通道视紫红质，KCR)的三维结构。
◆KCR是V体育官网渗透途径中存在于细胞外部的V体育官网选择过滤器，存在于细胞内部的脱水系统，以及在生理条件下形成的V体育官网浓度梯度3与已知的钾V体育官网通道完全不同，通过使用元素实现高钾V体育官网选择性KCR我们揭示了一种独特的V体育官网选择机制。
◆基于3D结构信息创建的钾V体育官网选择性进一步提高KCR突变体 (卡利) 预计将有助于神经科学和基因治疗的发展，作为实现下一代光遗传学实验的工具。

本研究摘要

演示文稿摘要

视紫红质通道蛋白（注）是一种膜蛋白，在光刺激下可传输V体育官网。1、2) 是一种“光遗传学工具”，可以光学控制实验动物活着时的神经活动。3)''已被广泛使用。最近，钾通道视紫红质选择性地转运钾V体育官网（KCR，注意4)被发现并有望成为抑制神经活动的理想光遗传学工具。但，KCR各方面都与已知的钾V体育官网通道完全不同，KCR选择性运输钾V体育官网一直是一个很大的谜团。
5)KCR的三维结构。电生理学（注）6)，光谱学（注7）和计算科学（注8),KCR是单元格外部的选择过滤器（注意9）以及生理条件下形成的V体育官网浓度梯度来实现高钾V体育官网选择性。
　钾V体育官网通道的V体育官网选择性的已知机制1998当年罗德里克·麦金农由博士阐明。2003虽然他在2007年获得了诺贝尔化学奖，但这项研究成果标志着大约四分之一个世纪以来首次阐明了生物体内全新的钾V体育官网选择机制。此外，该课题组开发的钾V体育官网选择性进一步提高。KCR突变体 (卡利) 有望作为下一代光遗传学实验的工具，为神经科学和基因治疗的发展做出贡献。
　该研究成果于2023年8月30日（东部夏令时间）发表在《美国科学杂志》上

演示内容

研究背景

　视紫红质是一种接收光的膜蛋白，参与多种生物现象，例如动物的视觉和微生物的趋光性。其中，负责响应光感受而使V体育官网渗透穿过细胞膜的V体育官网传输视紫红质，可以与基因转移技术和光学系统相结合，以高时空分辨率光学控制靶细胞的膜电位。这种被称为光遗传学的创新技术不仅在神经科学等基础生物学领域引起了广泛关注，而且近年来还被应用于人类疾病的基因治疗。
　在已作为光遗传学工具投入实际应用的V体育官网传输视紫红质中，通道视紫红质起着核心作用。视紫红质通道是一种光驱动的V体育官网通道，在光接收时打开并被动地跨细胞膜传输V体育官网。首次发现的视紫红质通道非选择性地转运包括钠V体育官网在内的各种阳V体育官网，并作为一种用光激活神经元的兴奋性光遗传学工具投入实际应用，至今仍被广泛使用。
另一方面，抑制神经元活动的“抑制性光遗传学工具”的开发却进展缓慢。目前使用的典型抑制性光遗传学工具是阴V体育官网通道视紫红质，它在光刺激下将氯V体育官网转运到细胞内部。然而，由于细胞内外氯V体育官网浓度的差异在轴突末端和突触末端是相反的，因此其使用范围受到了限制。在生理条件下，神经元活动的抑制是由钾V体育官网流出细胞时膜电位的复极化引起的。因此，钾V体育官网选择性通道视紫红质被认为是理想的抑制性光遗传学工具候选者。然而，已知的钾V体育官网通道在很多方面与视紫红质通道有很大不同，而且目前尚不清楚钾V体育官网选择性通道视紫红质是否可能存在。
　在这种情况下2022最后，从自然界选择性运输钾V体育官网2类型KCR（HCKCR1野生型和HCKCR2野生型)。然而，KCR与迄今为止报道的任何钾V体育官网通道没有序列同源性，KCR的光接收及其独特的钾V体育官网选择性的分子机制完全未知。

研究内容

这次，我们的研究小组使用冷冻电子显微镜HCKCR1野生型，HCKCR2基于结构信息的野生型和改进的钾V体育官网选择性HCKCR1 H225F突变体(KALI-1)总计3不同3D结构的分辨率26 埃、25 埃、27 埃(1 Å 是100十亿1米)已成功判定（图1）。这些KCR都在单体中7具有跨膜螺旋和视网膜分子，分别形成负责光响应的发色团3很明显它们形成了一个团块。

图1：HCKCR1野生型，HCKCR2野生型和HCKCR1 H225F突变体 (KALI-1)
HCKCR1 野生型，HCKCR2野生型，HCKCR1 H225F突变体 (KALI-1)分别是3形成单体，形成发色团的视黄醛结合到每个单体的中心。该图按单体着色。

　

　从这次得到的三维结构来看，第一KCR考虑了光感受的分子机制。根据之前的研究，HCKCR1野生型对绿光有反应HCKCR2已知野生型对较短波长的蓝光有反应，但尚不清楚为什么会出现这种响应波长的差异。这次获得HCKCR1野生型和HCKCR2对比野生型的三维结构，我们发现形成发色团的视网膜分子及其周围环境存在特征差异，即HCKCR1与野生型的其他视紫红质通道蛋白相似全-反式当视网膜类型被绑定时HCKCR2对于野生型6-s-顺式人们发现视黄醛的不同异构体（称为类型）结合在一起（图2）。这个6-s-顺式视网膜型，全-反式与模具相比，存在于视网膜尖端β-被称为紫罗兰酮环的环结构是扭曲的，这被认为是导致响应波长差异的原因。这种视网膜扭曲就在附近2我们假设这是由于氨基酸残基差异造成的空间位阻，因此我们通过使用突变体的光谱分析验证了这一假设，并成功验证了它。基于这些结果，β-我们能够阐明紫罗兰酮环附近的氨基酸与视紫红质通道的响应波长之间存在的普遍规则之一。

图2：HCKCR1和HCKCR2由于视网膜结构差异而产生的响应波长
(A)HCKCR1 野生型（左）和HCKCR2野生型（右）β-紫罗兰酮环和周围结构。HCKCR1对应于野生型苏氨酸和甘氨酸的氨基酸残基HCKCR2在野生型中，每个都是丙氨酸。β-紫罗兰酮环与图底部的丙氨酸产生空间位阻，HCKCR2在野生型中，这个环结构是扭曲的，6-s-顺式它有一个类型。特别是视网膜17第一个碳原子附近的氨基酸不是甘氨酸时，视紫红质通道蛋白的吸收波长会向较短波长侧移动。
(B) 全-反式输入（左）和6-s-顺式视网膜的化学结构（右）。

　

接下来，KCR的钾V体育官网选择机制。KCR的结构和典型的钾V体育官网通道KcsA的结构进行了比较。迄今为止已报道的所有钾V体育官网通道2量子和4形成聚体等多聚体结构，在多聚体界面具有V体育官网透过路径。此外，众所周知，该通路具有高度对称的V体育官网选择过滤器，并且该V体育官网选择过滤器能够选择性传输钾V体育官网（图3）。另一方面，KCR的V体育官网传输路径是3它们存在于每个单体中，而不是存在于单体界面处，并且存在于该途径的细胞外N99、W102、Y222说3我们发现特征性收缩位点是由两个氨基酸残基形成的（图3）。结合电生理学实验和计算科学实验的进一步分析表明，3氨基酸残基聚集形成的缢缩位点是KCR中独特的V体育官网选择过滤器。

图3：钾通道视紫红质KCR和典型的钾V体育官网通道KcsA的结构比较
已知的钾V体育官网通道（包括 KcsA）在多聚体界面处具有高度对称的选择性过滤器。形成该选择性过滤器的羰基氧原子之间的距离根据钾V体育官网的大小进行了优化，从而实现了对钾V体育官网的高选择性。另一方面，KCR是N99、W102、Y222特别是W102与钠V体育官网相比，与钾V体育官网形成更强的 π-阳V体育官网相互作用，因此KCR的高钾V体育官网选择性。 （但是，如下所述KCR的钾V体育官网选择性也很重要。 )

　

　另外，经过进一步的电生理实验，KCR研究发现，当细胞内外的V体育官网浓度组成颠倒、钠V体育官网和钾V体育官网的运输方向互换时，钾V体育官网选择性显着降低。当我们继续分析以阐明这种方向依赖性钾V体育官网选择性的分子基础时，我们发现KCR的细胞内部存在V体育官网脱水系统，当V体育官网从细胞内部进入V体育官网渗透通路时，无论是钠V体育官网还是钾V体育官网，当它们到达位于细胞外部的选择过滤器时，部分水合水被剥离，使其更容易通过选择过滤器。
基于上述内容，本研究描述了以下内容KCR我们提出了独特的钾V体育官网选择机制（图4）。在生理条件下，即当细胞内钾V体育官网浓度高、细胞外钠V体育官网浓度高时，钾V体育官网从细胞内部经过脱水系统，穿过过滤器，流出到细胞外，而完全水合的钠V体育官网和钙V体育官网则被V体育官网渗透途径中位于细胞外的选择性过滤器拒绝，从而导致钾V体育官网的选择性V体育官网转运。然而，在细胞内外V体育官网浓度反转的条件下，从细胞内部进入V体育官网渗透途径的钠V体育官网在到达细胞外部的选择性过滤器之前会部分脱水，从而使它们能够通过过滤器。由于钾V体育官网自由地通过选择性过滤器并被输送到细胞内，因此认为其结果是充当允许钠V体育官网和钾V体育官网通过的低V体育官网渗透性通道。

图4：KCR独特的钾V体育官网选择机制
左边是生理条件下，即细胞内钾V体育官网浓度高、细胞外钠V体育官网浓度高时KCR钾V体育官网选择机制右图表示细胞内外V体育官网浓度反转条件下的V体育官网透过机理。为了简单起见，KCR的7跨膜螺旋3第TM3和7第TM7，显示在V体育官网选择性和形成发色团的视黄醛中起重要作用的氨基酸残基。另外，钾V体育官网 (K⁺)，钠V体育官网(娜⁺)，钙V体育官网(加拿大²⁺)和水分子(H₂O)被示意性地表示。

　

此外，该研究小组根据结构信息进行了电生理分析，并开发了钾V体育官网选择性得到改善的改进版本KCR（K⁺-选择性增强光门V体育官网通道：KALI) 已成功创建。和卡利 (HCKCR1 H225F突变体) 的冷冻电子显微镜结构并与计算科学相结合，阐明提高其钾V体育官网选择性的机制，并利用培养细胞和活体小鼠进行抑制性光遗传学实验卡利但是KCR我们成功证明这是一种出色的光遗传学工具，可以比野生型更有效地抑制神经元活动（图5）。

图5：提高钾V体育官网选择性HCKCR1 H225F突变体 (KALI-1) 有效性实验
(A)HCKCR1 野生型和HCKCR1 H225F突变体 (KALI-1) 的双光子激发抑制神经活动的实验。H225F该突变可以比野生型更有效地抑制神经元活动。
(B) 使用活体小鼠进行大规模神经元记录的神经抑制效率评价实验。 （左图）KALI-1时每个光强度下的神经放电频率每个强度的神经元放电被记录多次，并且每个记录时间的神经元放电被绘制为点。 （右图）KALI-1是一种经典的抑制性光遗传学工具eNpHR33是啊HCKCR1与野生型相比，用较低的光强度可以更有效地抑制神经细胞。

未来展望

　该研究小组通过结合以冷冻电子显微镜结构分析为中心的多种技术，在大约四分之一世纪的时间里首次成功阐明了生物体所拥有的全新钾V体育官网选择机制。此外，一种对钾V体育官网选择性进一步提高的光遗传学工具卡利的开发这项研究不仅增进了我们对生物体中视紫红质和钾V体育官网通道分子进化的理解，而且卡利及更多KCR的有用突变体预计将有助于神经科学的发展，并在未来用于利用光遗传学的基因治疗。

相关新闻稿

“新型光驱动V体育官网通道的结构阐明和高性能分子工具的创建 - 揭示神经科学”(2022/02/03）

演示者

东京大学
　文理研究生院
加藤英明（副教授）〈兼：理学研究科〉
福田正宏（特聘助理教授）
田岛圣哉（博士课程）
岸浩一郎（博士课程）

凝聚态研究所
井上敬一（副教授）

V体育
工程研究生院
神取英树（特聘教授）
片山浩大（副教授）
杉浦正博（博士课程）

斯坦福大学
　生物工程系
卡尔·戴瑟罗斯（教授）
Yoon Seok Kim（博士后研究员）
YoungJu Jo（博士研究生）
王彼得（博士后研究员）

　计算机科学系
　　罗恩·德罗尔（教授）
Joseph Paggi（博士课程研究生）

论文信息

<杂志>细胞
<标题>钾选择性通道视紫红质V体育官网选择性的结构基础
<作者>Seiya Tajima、Yoon Seok Kim、Masahiro Fukuda、YoungJu Jo、Peter Y Wang、Joseph M Paggi、Masatoshi Inoue、Eamon FX Byrne、Koichiro E Kishi、Seiwa Nakamura、Charu Ramakrishnan、Shunki Takaramoto、Takashi Nagata、Masae Konno、Masahiro Sugiura、Kota Katayama、Toshiki E Matsui、Keitaro Yamashita、Suhyang Kim、Hisako Ikeda、Jaeah Kim、Hideki Kandori、Ron O Dror、Keiichi Inoue、Karl Deisseroth*、加藤秀明*
<DOI> 101016/jcell202308009
<网址>

研究补助金

这项研究是由国家研究开发机构、日本科学技术振兴机构 (日本标准时间）「日本标准时间紧急研究支持项目（项目编号：JPMJFR204S）」、「JST 冠（作业编号：摩根大通JCR21P3)”、“JST ACT-X（作业编号：JPMJAX222F）”、“JST SPRING（作业编号：JPMJSP2108）”、“日本标准时间急速(作业编号：JPMJPR19G4)”，科学研究资助金“学术转型领域研究(B)(项目编号：21H05142)”, “基础研究(A)（项目编号：22H00400）”，“具有挑战性的研究(发芽)(项目编号：22K19265)'', ``新学术领域的研究(研究领域提案类型)（项目编号：22H04742）”、“青年研究员（项目编号：23K14142）”、“挑战性研究(发芽)(项目编号：20K21383)”, “基础研究(B)(项目编号：21H01875)”, “重点推广研究(作业编号：21H04969)”，日本医学研究与发展机构 (AMED) “大脑与心智研究推广计划（项目编号：JP21wm0525018）」、UTEC该项目得到了东京大学未来社会协同创造基金、中谷医学和工程测量技术促进基金会、三菱财团和风里研究基金会的支持。

术语表

（注意1)视紫红质
一种感光蛋白，存在于从人类到微生物的许多生物中。作为通用结构7它是一种具有跨膜螺旋的膜蛋白，其中心结合有一种称为视黄醛的小分子，作为负责光吸收的发色团。

（注意2)视紫红质通道
视紫红质充当“V体育官网通道”，响应光刺激沿着V体育官网电化学梯度传输V体育官网。2002从藻类中发现。由于细胞膜由脂质双层膜组成，因此本质上对V体育官网是不可渗透的，但细胞膜中存在的称为V体育官网通道的膜蛋白使得根据细胞内外的浓度梯度输送V体育官网成为可能。

（注意3）光遗传学
光电（光）遗传学（遗传学）是单词 33691_33763| （遗传学），是利用基因技术在特定神经细胞中表达感光蛋白，并利用光来控制神经细胞活动的技术。斯坦福大学卡尔·代瑟罗斯由博士实现。

（注意4)KCR（钾通道视紫红质）
Chanrhodopsin 选择性转运钾V体育官网，这是生理上重要的V体育官网之一。20222017 年首次在自然界中发现(戈沃鲁诺瓦等., 自然。神经科学。 (2022))报道HCKCR1和HCKCR2与钠V体育官网相比，钾V体育官网大约是20它具有两倍的透明度，有望用作抑制神经的光遗传学工具。

（注意5) 冷冻电子显微镜
获得 2017 年诺贝尔化学奖的技术。与典型的光学显微镜不同，该方法在极低温环境（冷冻）下用电子束照射蛋白质样品，并根据投影图像计算三维结构。这种方法之所以引起人们的关注，是因为它显着减少了蛋白质结构分析所需的时间。

（注意6) 电生理学
研究V体育官网通道特性的实验技术。除了通过的V体育官网类型（V体育官网选择性）之外，还可以详细研究通道打开和关闭所需的时间（动力学）及其对光和电势的响应。

（注意7) 光谱
通过用光照射样品并分析透射光和散射光1一种实验技术，可让您在原子水平上研究分子状态。由于视紫红质具有吸收光的性质，因此与光谱学兼容，长期以来利用光谱学进行视紫红质的分子分析。

（注意8）计算科学
一种计算模拟量子化学现象（例如蛋白质动力学和激发）的方法，这些现象很难通过实验进行研究。

（注意9) 选择过滤器
一种用于选择性传输V体育官网通道中特定V体育官网的结构。钾V体育官网通道的结构是1998当年洛克菲勒大学罗德里克·麦金农2研究人员2003荣获2016年诺贝尔化学奖。

联系信息

研究相关

东京大学文理研究生院广泛科学研究科高级科学研究组织
加藤秀明副教授
电话：03-5452-6483
电子邮件：c-hekato[at]geccu-tokyoacjp

V体育工学研究科工学部（生命与应用化学领域）
特聘教授神取英树
电话：052-735-5207
电子邮件：kandori[at]nitechacjp

V体育工学研究科工学部（生命科学和应用化学领域）
片山幸太副教授
电话：052-735-5218
电子邮件：katayamakota[at]nitechacjp

与举报相关的事宜

东京大学艺术研究生院公共关系办公室
电话：03-5454-6306
电子邮件：pro-wwwc[at]gsmailu-tokyoacjp

东京大学固体物理研究所公共关系办公室
电话：04-7136-3207
电子邮件：press[at]isspu-tokyoacjp

V体育企划公关科
电话：052-735-5647
电子邮件：pr[at]admnitechacjp

请将 *[at] 替换为 @。