发现可治疗色素性视网膜炎的小分子V体育~建立基于V体育的视网膜疾病基因治疗新方法~

演示要点

〇〇我们发现了一种来自美洲驼的特殊V体育，称为纳米V体育（注2），它特异性识别在眼睛感光中发挥作用的蛋白质（视紫红质（注1）），并利用X射线晶体学阐明了视紫红质和纳米V体育之间的复合物的三维结构（注3）。
〇〇纳米V体育已被证明能够防止视紫红质的蛋白质变性（错误折叠（注4））和过度光活化（持续活跃）（注5）。
〇〇纳米V体育有望促进色素性视网膜炎（注6）治疗方法的开发，色素性视网膜炎会导致中心视力、夜视和色觉下降。

摘要

　渡边航平，V体育工学研究科（研究时：工学部生命与应用化学专业硕士课程第2年），神取英树特聘教授，片山浩大副教授领导的研究小组通过与加州大学尔湾分校特聘教授Krzysztof Palczewski等人领导的研究小组进行国际联合研究，发现了一种特殊的化学物质。美洲驼衍生的抗体称为纳米抗体，可特异性识别视紫红质。此外，我们利用X射线晶体学阐明了视紫红质与纳米抗体结合的复合物的三维结构，并通过结合各种光谱测量技术和生化技术，我们揭示了纳米抗体可以防止视紫红质的错误折叠和过度光活化。视紫红质是人眼视网膜中重要的感光分子，视紫红质基因的突变可导致色素性视网膜炎的发生，这是一种感光功能受损的疾病，因此希望新发现的纳米抗体能够促进色素性视网膜炎治疗方法的开发。
　该研究成果于2023年8月29日发表在《美国科学杂志》上。》杂志。

本研究结果摘要

研究背景

　色素性视网膜炎是一组遗传性、进行性眼部疾病，会导致眼睛后部视网膜异常。据估计，在日本，每 4,000 至 8,000 人中就有 1 人患有这种疾病，其特征症状包括夜盲症、视野狭窄和视力下降。视网膜中有两种感光细胞：视杆细胞和视锥细胞（注7），它们分别负责我们的明视觉、暗视觉和色觉。色素性视网膜炎通常是由这两种感光细胞的视杆细胞受损引起的，首先出现的症状包括在黑暗中视力困难（夜盲症）和视野狭窄。随着疾病的进展，视锥细胞受损，患者意识到视力下降。目前，色素性视网膜炎尚未建立根本治疗方法，全球范围内正在积极开展基因治疗、神经保护、细胞移植等研究。
　视紫红质是视杆感光细胞中含有的一种分子，负责感光功能的起源，人们认为视紫红质的各种基因突变会导致色素性视网膜炎（图1）。色素性视网膜炎患者的视紫红质基因已被证实有超过150种突变。这些视紫红质基因突变会导致蛋白质错误折叠和异常，即无论光刺激如何，视紫红质都会不断激活。异常形式根据视紫红质基因突变的位置而异，因此很难开发出特异性的靶向基因疗法。

图1 视紫红质突变体引起的视网膜色素变性的发展

　

　此外，对于针对视紫红质的药物发现和基因治疗方法的开发，阐明支持视紫红质的光感受器功能的分子基础非常重要。视紫红质属于G蛋白偶联受体（GPCR（注8））家族，是第一个被确定X射线晶体结构的GPCR，虽然其功能的分子机制经过了最先进的研究，包括各种光谱分析、功能分析和计算科学分析，但其功能的全部细节尚未阐明。例如，在视紫红质表达视觉功能的光反应过程中被认为生理上重要的毫秒至秒的时间范围内，金属视紫红质I(meta-I)和活性中间体金属视紫红质II(meta-II)处于pH平衡关系，但仅阐明了meta-II的三维结构(已经确定了直至meta-I生成的光反应中间体的结构)，以及对蛋白质内部发生的分子机制的理解，直到meta-II的形成被延迟。如果阐明导致激活的所有结构，并基于结构基础深化激活的分子机制，预计这将导致药物发现和基因治疗研究，以防止由于视紫红质活性过度而导致的视杆细胞退化。此外，如上所述，视紫红质是GPCR中经过最多研究阐明其分子机制的分子，因此可能为控制GPCR激活和失活的药物设计提供新的指导方针。

研究内容/结果

　该研究小组成功获得了一种特殊类型的美洲驼衍生V体育，称为纳米V体育，它可以阻止视紫红质的光激活过程，并使分析meta I中间体的3D结构成为可能，目的是确定meta I中间体的高分辨率结构，其3D结构是视紫红质光激活过程中产生的中间体中尚未阐明的。具体而言，使用以牛视紫红质为抗原的美洲驼生产的30种纳米V体育低分子V体育，通过ELISA法（酶联免疫吸附测定法鉴定后（注9））、免疫共沉淀法（注10）、Blue-Native聚丙烯酰胺凝胶电泳（注11）以及光/非光条件下的表面等离子共振光谱法。通过使用（注12）评估视紫红质和纳米V体育之间的结合亲和力的实验，我们最终成功获得了仅在光存在下才与视紫红质特异且强烈结合的四种纳米V体育低分子V体育。 （图2a）。
因此，通过在光存在下将获得的四种纳米V体育和视紫红质混合并尝试X射线晶体结构分析，我们成功地以37 Å（1 Å为十亿分之一米）的分辨率阐明了其中一种纳米V体育和视紫红质之间的复合物（视紫红质-纳米V体育复合物）的三维结构（图2b）。所得视紫红质-纳米V体育复合物形成二聚体。此外，纳米V体育与大范围的视紫红质表面区域结合，包括细胞外部的第二个环（注13）。特别是，揭示了纳米V体育低分子V体育的高变区CDR1和CDR3（注14）通过静电和分子间相互作用与视紫红质细胞外第二环中的氨基酸结合（图2c）。此外，通过纳米V体育CDR1和CDR3区域的氨基酸突变实验，我们成功地鉴定了对于与视紫红质结合特别重要的氨基酸。

图2(a)使用凝胶电泳的纳米V体育结合实验
(b) 视紫红质和纳米体复合物的X射线晶体结构
　　　(c) Nanodi 高变区 CDR1 和 CDR3

　

接下来，为了阐明视紫红质-纳米V体育复合物结构处于哪种中间状态，我们利用紫外-可见吸收光谱和透射红外吸收光谱进行分析，结果表明视紫红质-纳米V体育复合物是Lumi/Meta I-like中间体（图3a）。换句话说，正如预期的那样，所获得的纳米V体育抑制了视紫红质的光活化并在结构上稳定了活性前体。此外，为了阐明纳米V体育抑制视紫红质活化的机制，研究组进行了荧光光谱和液相色谱-质谱联用分析，发现纳米V体育的结合抑制了视紫红质内部结合的视网膜席夫碱的水解反应（图3b）。一般来说，在吸收光之前视紫红质的初始状态下，视网膜希夫碱带正电，并通过与附近带负电的谷氨酸的静电相互作用而稳定。然而，在光活化后，希夫碱的质子分离，引起细胞质区域的结构变化。然后，去质子化的希夫碱进行水解反应，视黄醛从视紫质蛋白的内部解离。这次，解释为纳米V体育与视紫红质第二胞外环的结合稳定了视网膜结合位点的蛋白质环境，抑制了质子解吸反应，从而抑制了光活化。
　该研究小组还假设纳米V体育也可能在抑制视紫红质错误折叠方面发挥作用。因此，我们利用免疫荧光成像分析了纳米V体育对视紫红质P23H（第23位脯氨酸残基突变为组氨酸残基）突变体的抑制作用，该突变体已知会因视紫红质错误折叠而导致色素性视网膜炎（注15）。据认为，视紫红质P23H突变体的蛋白质折叠过程出现异常，不能正确转运至细胞膜，且定位于内质网，导致视杆感光细胞变性，最终发展为色素性视网膜炎。正如预期的那样，在共表达视紫红质P23H突变体和纳米V体育的哺乳动物细胞（HEK293细胞）中，确认了视紫红质P23H突变体在细胞膜上的表达与野生型相当，表明纳米V体育抑制了视紫红质P23H突变体的错误折叠，从而将其正确转运至细胞膜。上述结果表明，新获得的纳米V体育不仅抑制视紫红质的光活化，而且抑制其错误折叠。

图3(a) 纳米V体育存在下视紫红质的光诱导红外差异光谱
　　　(b) 在纳米V体育存在下通过视紫红质荧光光谱法评估褪色

社会意义/未来展望

　通过确定视紫红质中唯一的三维结构尚未阐明的meta-I中间体样结构，我们阐明了导致激活的部分分子机制。特别是，之前已知细胞外部视网膜结合位点的变化会传递到细胞质区，这对于后续光反应过程中的信息传递非常重要，但这项研究表明，细胞外区存在的高自由度环结构变构控制着细胞质区的大结构变化。这有望为针对 GPCR 的药物发现研究提供新的设计指南。此外，本研究对象的纳米V体育低分子V体育分子量小、稳定、可溶，能够识别通常V体育无法接近的表位（V体育在抗原内结合的位点），作为可以替代正常V体育的有希望的V体育治疗剂而受到关注。事实上，该研究小组已经开始研究将纳米V体育低分子V体育基因导入小鼠模型动物中治疗色素性视网膜炎，并计划评估其对视杆细胞死亡的抑制和视力改善的效果。此外，这项研究的结果有望使目前尚未确定治疗方法的视网膜色素变性的基因治疗成为可能，并被选为《自然通讯》杂志的编辑亮点，并在美国多家媒体上进行专题报道（网址如下）。

·NEI 研究新闻，2023 年 8 月 31 日：
·眼科时报 2023 年第 1 集：
·2023 年 8 月 31 日眼科突发新闻：
·EyeWire 新闻，2023 年第 1 集：

·OPPToday（加拿大）、Mirage News（澳大利亚）、Amplify Eyecare、Futurity、Newsbreak、Newswise、Physorg、Technology Networks、ISP Today、CityLife 等。

这项研究成果基于日本科学技术振兴机构 (JST) 战略创意研究促进项目。 PRESTO“利用量子技术创建生命科学基础设施”研究领域研究课题：“基于结构基础的颜色识别机制和色视觉信息传输机制的阐明”（JPMJPR19G4），2019年通过（研究员：片山浩大），得到科学研究补助金（特别促进研究）的支持。

术语表

（注1）视紫红质
视杆细胞中负责眼睛视网膜明视和暗视的感光蛋白称为视杆细胞物质或视紫红质。在包括人类在内的各种生物体中已发现超过 10,000 个分子。它具有七次跨膜蛋白质结构，维生素A的衍生物视黄醛作为发色团结合在蛋白质内部。

(注2)纳米V体育
免疫球蛋白（V体育）的可变区，仅由与靶抗原结合的重链组成。一种低分子V体育，有时称为单链V体育或单域V体育。已知骆驼科哺乳动物，如羊驼、骆驼和美洲驼，体内产生仅由重链组成而不含轻链的免疫球蛋白。

(注3)X射线晶体结构分析
它是一种利用入射到晶体结构上的X射线在许多特定方向上衍射的性质来确定晶体的原子和分子结构的分析方法。可以确定多种信息，例如晶体内原子的平均位置、化学键合和晶体无序性。

（注4）错误折叠
蛋白质通过氨基酸的三维折叠形成独特的三维结构（天然结构）来发挥其功能。另一方面，当蛋白质无法正确折叠，或者已正确折叠的蛋白质的天然结构变性（错误折叠）时，就会发生疾病。众所周知，它是阿尔茨海默病和帕金森病等疾病的原因。

（注5）光活化过度（持续活跃）
视紫红质通过吸收光后蛋白质部分的结构变化而被激活来传递光学信息，但当它即使在没有光刺激的情况下也被激活并处于可以传递信息的状态时，称为恒定活性或组成活性。持续的激活使得无法区分开和关的光信息，导致夜盲症和色素性视网膜炎。

(注6)色素性视网膜炎
这是一种遗传性进行性疾病，由于遗传异常，会导致眼睛的感光视网膜异常。发病率估计为 4000-8000 人中就有 1 人发病。症状包括夜盲症、隧道视力和畏光，并且视力随着疾病的进展而恶化。

(注7)视杆细胞和视锥细胞
动物视网膜中有两种类型的感光细胞：视杆细胞和视锥细胞。两者都是检测光并将其转化为神经信息的细胞，并且它们彼此非常相似。它们对光的反应有两个主要差异。第一点是对光敏感度的差异，视杆细胞对光的敏感度明显高于视锥细胞。这就是为什么我们可以使用视杆在黑暗中看到东西。第二点是光响应持续时间的差异。对于相同的光刺激，视锥细胞的反应比视杆细胞短。因此，在视锥细胞工作的强光环境中，可以以更高的时间分辨率看到光刺激的变化。通过使用两种具有不同反应的感光细胞，我们可以在不同的光环境下看到事物。

（注8）G蛋白偶联受体（GPCR）
它是一种存在于细胞膜中的七次跨膜蛋白，已知形成最大的家族（人类中大约有 800 个物种）。 GPCR 仅由特定的细胞外药物或配体激活，跨膜位点的结构变化能够激活细胞内的三聚体 G 蛋白。 GPCR靶向药物占现有药物的30%以上，因为它们发挥着控制人类几乎所有生命现象的作用。

(注9)ELISA法(酶联免疫吸附测定法)
一种酶免疫测定 (EIA)，使用V体育来量化目标分子。V体育用于特异性识别目标分子，例如肽、蛋白质、V体育和小分子。 ELISA 的一个特点是它在放大信号的同时检测溶液中的样品。

(注10)免疫共沉淀法
识别相关蛋白质之间生理相互作用的通用方法。目标蛋白特异性V体育用于间接获得与目标蛋白结合的蛋白质。可以分析获得的蛋白质复合物以鉴定新的结合配偶体、结合亲和力、结合模式和目标蛋白质的功能。

(注11) Blue-Native聚丙烯酰胺凝胶电泳
Blue-Native 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN-PAGE) 是 Native PAGE 的一种，是研究具有复杂结构的蛋白质和膜蛋白复合物的大小和分子种类的有用方法。常规 SDS-PAGE 分离变性状态的蛋白质，而 BN-PAGE 可以根据蛋白质的分子大小分离蛋白质，同时保留其高阶结构和复杂结构。此外，通过进行二维眼电泳（SDS-PAGE），可以研究作为靶标的复合物中包含的单个蛋白质的组成。

(注12)表面等离子体共振光谱
这是一种研究方法，可让您实时跟踪表面上分子的吸附和解吸行为，而无需标记为金属表面附近折射率的变化。除了测量吸附分子的膜厚（吸附量）外，还可以根据实时测量结果进行吸附/脱附速度等动力学分析。

（注13）循环
多肽链是蛋白质的一级结构，通过主链的N-H和C=O基团之间形成氢键，形成螺旋或片状二级结构。其中，螺旋结构被称为α-螺旋结构。另外，当不形成氢键时，形成线状环结构。

（注释14）高变区CDR1和CDR3
CDR区是V体育分子中与抗原直接接触的可变区。重链(VH)和轻链(VL)各有3个(CDR1、CDR2和CDR3)，其中CDR3被认为最参与结合。 CDR是V体育的抗原识别位点，因此也称为高变区，因为它们的氨基酸序列在V体育之间差异很大。

（注15）免疫荧光染色成像
使用荧光标记V体育成像，免疫荧光 (IF) 使用V体育和荧光检测来研究固定细胞和组织内目标蛋白的定位、相对表达和激活状态。具体来说，可以研究（1）表达目的蛋白的细胞和组织，（2）改变目的蛋白的表达和活性的因素，（3）细胞和组织内目的蛋白的定位，以及（4）细胞和组织结构内不同目的蛋白的空间关系。

论文信息

论文标题：通过纳米V体育与其胞外结构域结合进行视紫红质变构调节的结构基础
作者姓名：Arum Wu、David Salom、John D Hong、Aleksander Tworak、Kohei Watanabe、Els Pardon、Jan Steyaert、Hideki Kandori、Kota Katayama*、Philip D Kiser*、Krzysztof Palczewski*
*通讯作者
出版杂志名称：Nature Communications
发布日期：2023 年 8 月 29 日
DOI：

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V体育工学研究科工学部（生命科学和应用化学领域）
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