V体育乙酰胆碱受体激活的关键~阐明GPCR机制的新一步，拓展下一代药物设计的可能性~

V体育／关西医科大学／东北大学／京都大学

演示要点

〇毒蕈碱乙酰胆碱受体（M₂R)^（注1）中第404位天冬酰胺残基（Asn404）的红外信号^（注2）识别
〇M₂R 激活中的跨膜螺旋 6 (TM6)^(注3）
〇G蛋白偶联受体（GPCR）^（注4）我们希望为阐明整体激活机制提供新的视角，并为神经退行性疾病、痴呆、心脏病等药物V体育研究做出贡献

摘要

V体育工学研究科生命与应用化学系生命与应用化学学科杉浦佑也先生（研究时）、生命与应用化学系副教授片山浩大、关西医科大学医学院特聘教授神取英树、柴田哲夫教授、澄井佑二副教授等小组，其中包括清水卓也教授本科生医学化学系的小林教授和久野良二副教授、东北大学药学研究生院的井上明日香教授和生田达也助理教授、京都大学医学研究生院的岩田壮教授正在进行振动光谱研究。^{（注意5）}₂R) 是一种内源性激动剂^{（注意6）}被乙酰胆碱激活。

在这项研究中，M₂R 配体^{（注意7）}M₂我们V体育它对于R的激活极其重要。我们还揭示了N404Q突变体部分表现出与活性形式相似的结构变化，并V体育支持这种相互作用的水分子形成灵活而精确的氢键网络，导致跨膜螺旋6（TM6）的结构变化。

此外，如果乙酰胆碱分子的特定部分经过化学修饰以破坏这种氢键网络，M₂我们已确认R无法正常激活。从这些结果来看，Asn404 感知到乙酰胆碱和 M₂它被证明是诱导 R 激活的关键残基。

这项研究成果不仅为阐明 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 激活的整个机制开辟了一条新途径，而且有可能为下一代药物设计提供创新指南。

研究详情将于 2025 年 3 月 14 日发布“》杂志。

研究背景

蛋白质等生物分子通过动态改变其结构来发挥其功能。 GPCR是一种参与体内平衡和感觉器官等多种信号转导的膜蛋白，当它从细胞外接收到配体时，它会通过氢键网络重组等动态变化，诱导细胞内发生较大的结构变化。接受配体的 GPCR 然后通过信号转导蛋白（例如 G 蛋白）激活信号转导途径，从而导致多种细胞反应。

最近，利用NMR等光谱方法V体育，该信号转导途径的激活程度（药效）源自配体结合时GPCR动态结构变化的差异。除了 GPCR 与配体或信号转导蛋白之间复合物的静态结构信息外，获取 GPCR 激活过程中动态结构变化的信息也很重要。

特别是在体内，GPCR 具有多种功能和表达位点不同的亚型，但它们的配体结合位点极其相似。尽管如此，人们认为不同的细胞反应在体内持续且正确表达的原因是每种受体亚型准确且自由地识别相同的内源配体或相似化合物，并执行后续信号传导。因此，如果我们能够有效地利用结合了 GPCR 运动性的动态结构变化信息，就有可能开发出利用亚型之间细微差异的药物，而这些差异无法从一级氨基酸序列或 3D 结构的快照中得出。

迄今为止，该研究小组已经优化了红外光谱，并进行了研究，以测量当配体或信号转导蛋白与 GPCR 结合时发生的动态结构变化的光谱，即分子振动的变化。具体来说，我们一直致力于通过将溶液循环系统连接到红外光谱仪并通过吸附在测量基板上的GPCR使具有不同效力的配体流动来测量配体结合之前和之后的红外差异光谱。因此，毒蕈碱受体之一 M₂M对应于药物功效的差异，例如R的激动剂和抑制剂₂R的结构变化作为红外差异光谱（图1）。还值得注意的是，该方法是在接近自然环境的条件下测量的。此外，我们以小于1秒的时间分辨率追踪配体浓度依赖性以及与受体的结合/解离，使得定量分析动态变化成为可能。

研究内容/结果

这次，基于光谱分析，该研究小组₂我们的目标是以原子分辨率阐明从 R 接受配体到信号转导的一系列动态结构变化。为此，我们使用配体的氨基酸变体和同位素标记衍生物进行测量，并通过结合计算科学，我们试图将红外信号归因于结构变化。

具体而言，我们使用 N404Q 突变体进行了测量，其中第 404 个天冬酰胺残基 (Asn404)（构成天然配体乙酰胆碱结合位点的氨基酸之一）被谷氨酰胺残基 (Gln) 取代，并成功归因于与乙酰胆碱结合时与 Asn404 氢键变化相对应的红外信号（图 2a）。另外，乙酰胆碱¹³使用 C 同位素标记的样品 M 进行测量₂R结合的乙酰胆碱的红外信号（图2b）。

还有重水 (²H₂O)（图3a，b）中的测量之外，M₂我们对乙酰胆碱与 R 的结合进行了分子动力学 (MD) 模拟分析（图 4）。结果表明，水分子介入乙酰胆碱和Asn404之间，形成具有适当灵活性（精度和自由度之间的平衡）的相互作用。此外，这个精致的氢键是M₂我们表明它对于 R 的激活很重要（图 3c）。

这项研究揭示了水分子形成的灵活而精确的氢键网络如何驱动结构变化和受体激活。此外，通过应用 Asn404 介导的微观相互作用的变化，M₂我们提出了设计可自由控制R活性的乙酰胆碱衍生物的指南。这项研究结果是重要的成果，为阐明GPCR的激活机制提供了新知识，并为下一代创新配体设计奠定了基础。

社会意义/未来展望

蛋白质结构分析使生物现象可视化，但由于结构测定方法的重大技术创新，我们现在正从捕捉静态图像的阶段转向捕捉实际运动的蛋白质的动态图像的阶段。特别是，使用X射线自由电子激光器的时间分辨晶体结构分析和从冷冻电子显微镜测量获得的蛋白质颗粒的结构异质性图像重建结构动力学的结构分析正开始在原子水平上揭示GPCR和膜蛋白操作过程中的中间体结构。

然而，通过实验了解哪种化学相互作用变化会诱导蛋白质内中间体之间的转变或激活的例子仍然有限。在这种情况下，本研究值得注意的一点是，我们将对氢键等化学变化敏感的红外光谱应用于GPCR，并且能够检测配体结合时受体和配体本身发生的动态结构变化。

基于使用红外光谱的光谱数据，这项研究结果阐明了蛋白质内部化学相互作用发生变化的位置。预计这项研究结果将带来突破性进展，将显着推进对 GPCR 亚型选择性、信号选择性和药效控制机制的理解，而这些对于 GPCR 操作机制仍不清楚。这些知识有望成为新药V体育的基础，并为医学领域创新疗法的开发铺平道路。

此研究成果基于日本科学技术振兴机构 (JST) 战略创意研究促进项目。 PRESTO“利用量子技术创建生命科学基础设施”（JPMJPR19G4）（研究代表：片山浩大）、日本学术振兴会科学研究补助金的基础研究（B）（研究代表：片山浩大）（项目编号：23K21097）、特别推进研究（研究代表：神取英树）（项目编号： 21H04969）、基础研究（B）（研究代表：久野亮司）（项目编号：19H03428、2402231）、学术转化领域研究（B）（研究代表：寿亮司）（项目编号：21H05112）、学术转化领域研究（B）（研究代表：井上飞鸟）（项目编号： 21H05111、21H05113）、基础研究（A）（研究代表：井上明日香）（项目编号：21H04791）、挑战研究（开拓性）（研究代表：井上明日香）（项目编号：24K21281）、日本科学技术振兴机构（JST）新兴研究支援项目（FOREST）（研究代表：明日香）井上）（项目编号：JPMJFR215T）、内阁府（CAO）Moonshot研发系统（研究代表：井上明日香）（项目编号：JPMJMS2023）、日本医学研究开发机构（AMED）（研究代表：井上明日香）（项目编号：JP22ama121038、JP22zf0127007）。

术语表

（注1）毒蕈碱乙酰胆碱受体 (M₂R）
一种膜蛋白，是 G 蛋白偶联受体，接受乙酰胆碱（一种与帕金森病和阿尔茨海默病有关的神经递质）作为天然配体。 5 种亚型 (M₁R 到 M₅R)存在，本研究目标M₂R主要分布在心脏中并以抑制方式调节心脏功能。

（注2）红外信号
指分子吸收或透过红外光时观察到的光谱信息。具体来说，它表现为当分子内的特定化学键吸收红外光特定波数（频率）的能量时出现的峰（吸收带）。

（注3）跨膜螺旋6（TM6）
在膜蛋白（特别是 G 蛋白偶联受体）中，它指的是跨越细胞膜的 α 螺旋结构的第六螺旋。

（注4）G蛋白质偶联受体 (GPCR）
一种膜蛋白，可穿透细胞膜七次，是将细胞外信号（激素、神经递质、光、气味等）传递到细胞内的受体。它在体内信号转导中发挥核心作用，是许多药物的靶标。

（注5）振动光谱
一种通过测量与分子振动（例如键拉伸和弯曲运动）相关的能量来分析材料的结构和化学环境的方法。当分子具有特定的振动模式时，它会吸收特定波长的光。

（注6）内源性激动剂
作用于体内受体分子并表现出与神经递质和激素类似功能的药物。体内自然产生并激活特定受体的物质。

（注7）配体
与特定受体或蛋白质结合并触发体内信号传输或生化反应的分子。

论文信息

论文标题：V体育 M 中的关键激活热点₂毒蕈碱受体
作者姓名：Yuya Sugiura、Tatsuya Ikuta、Yuji Sumii、Hirokazu Tsujimoto、Kohei Suzuki、Ryoji Suno、Putri Nur Arina Binti Mohd Ariff、So Iwata、Norio Shibata、Asuka Inoue、Takuya Kobayashi、Hideki Kandori、Kota Katayama
出版杂志名称：Journal of the American Chemical Society
发布日期：2025 年 3 月 14 日
DOI：101021/jacs4c14385
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联系信息

研究很重要

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片山浩大副教授
电话：052-735-5218
电子邮件：katayamakota[at]nitechacjp

V体育生命与应用化学系
柴田哲夫教授
电话：052-735-7543
电子邮件：shibatanorio[at]nitechacjp

关西医科大学医学部医学化学系
清水卓也教授（小林）
电话：072-804-2340
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京都大学药学研究生院生物功能分析系
东北大学药学研究生院分子细胞生物化学系
井上明日香教授
电话：022-795-6861
电子邮件：iaska[at]tohokuacjp

京都大学医学研究生院分子细胞信息学系
岩田聪教授
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