首次发现与自然光作用的磷酸二酯酶分子~有望作为新的光遗传学工具应用~

1. 从鞭毛毛毛虫的DNA序列信息中，在自然界中首次发现了一种响应光而发挥作用的蛋白质（光开关磷酸二酯酶）。
2. 通过将这种蛋白质引入人体细胞，我们成功地通过光照射抑制了环核苷酸的浓度，环核苷酸在代谢调节、细胞分化和增殖等多种生物功能中发挥着作用。
3. 作为一种用光自由操纵生物功能的工具，它有望为阐明生命现象做出贡献。

JST 战略创意研究推广项目发现了一种利用光降解环核苷酸（注 1）的蛋白质（Rh-PDE），环核苷酸是重要的细胞内信号转导器。 　用光操纵生命现象的技术称为光遗传学，近年来取得了快速进展。特别是，使用光开关离子传输分子注2)的神经活动光操纵技术为阐明脑神经功能做出了巨大贡献。另一方面，可通过光操纵降解细胞内信号转导器的分子类型有限，人们一直在等待它们的发现和开发。 　研究人员 Tsunoda 和其他人关注的事实是，一种名为三叶鞭毛注 3) 的微生物在其基因组中具有针对光感受器视紫红质注 4) 和磷酸二酯酶 (PDE) 注 5) 的连续遗传密码注 6)。我们还证明，该基因 (Rh-PDE) 产生的蛋白质在光反应下表现出环核苷酸降解活性。当这种蛋白质被引入培养的人类细胞中时，他们成功地通过光照射抑制了细胞内的环核苷酸浓度。 　Rh-PDE可作为光遗传学工具应用于细胞内信号转导的光学操纵技术，并有望用于阐明代谢调节和细胞分化等生物现象。环核苷酸还与呼吸系统疾病、痴呆、色素性视网膜炎等疾病密切相关。如果建立使用Rh-PDE光学操纵细胞内信号转导的方法，则有望有助于阐明这些疾病的机制。 　这项研究是、，以及加拿大圭尔夫大学的 Leonid Brown 教授。 　这项研究成果即将发表在美国科学期刊《生物化学杂志》上。

此成果是通过以下项目、研究领域和研究主题获得的。 战略创意研究促进项目个人型研究（PRESTO） 研究领域：“阐明生物功能机制的光操纵技术” （研究主管：京都大学研究生院理学研究科教授七田义德） 研究项目名称：使用新酶视紫红质挑战视觉再现 研究员：Satoshi Tsunoda（日本科学技术振兴机构首席研究员/V体育客座副教授） 研究地点：V体育 研究期间：2016年10月至2020年3月

研究背景和历史

　环AMP和环GMP注7)是环状核苷酸，是调节细胞内各种酶的功能的细胞内信号传递体。环核苷酸根据需要合成并被磷酸二酯酶 (PDE) 降解，以维持细胞内适当的浓度。
光遗传学是将具有光开关功能、能在有光或无光的情况下开启和关闭的生物分子引入细胞和组织中，通过光照射来控制其功能的技术。这项技术在神经科学领域尤其强大，为阐明记忆形成和阿尔茨海默病的机制做出了巨大贡献。然而，能够光学操纵细胞内信号转导的分子仍然有限。因此，在这项研究中，我们的目标是发现能够用光自由操纵细胞内环核苷酸浓度的光感受器分子。

研究内容

　研究人员 Tsunoda 和他们的同事重点研究了顺序编码微生物视紫红质和磷酸二酯酶的基因，这些基因存在于鞭毛毛毛虫 (Choanomonada) 的 DNA 序列信息中，这一信息已经被揭示。首先，我们成功纯化了该基因产物的蛋白质。我们将这种蛋白质命名为Rh-PDE（图中的A）。当我们在试管中研究Rh-PDE的活性是否受到光的影响时，我们发现环AMP和环GMP的分解活性随着490纳米蓝绿光的照射而增加（图B）。
　为了进一步研究光的激活机制，我们通过光谱验证了视紫红质位点（即Rh-PDE的光感受器位点）的光反应特性。结果表明，Rh-PDE在光照射后约7秒就完全激活，当光关闭时，其活性在几分钟内减弱并恢复到原来的状态。
　接下来，为了验证Rh-PDE在人体细胞中是否具有相同的作用，我们将Rh-PDE引入培养的人体细胞HEK293细胞注8)。当我们检测环AMP浓度随时间的变化时，我们成功地观察到环AMP浓度响应蓝绿光照射而下降（图中的C和D）。换句话说，表明使用Rh-PDE可以光学操纵细胞内环核苷酸浓度。

未来发展

　未来，我们将从结构和酶学角度阐明Rh-PDE如何通过光吸收发挥其环核苷酸降解活性的详细分子机制。此外，Rh-PDE是自然界中发现的第一个光开关Rh-PDE，阐明其生理意义和作用具有重要意义。
　Rh-PDE 可用作光遗传学工具，预计可用于细胞内信号转导的光学操纵技术。然而，要做到这一点，需要利用基因修饰技术来提高新发现的Rh-PDE的光开关功能和环核苷酸选择性。环核苷酸调节细胞内现象，例如代谢调节、细胞分化和增殖。因此，为了阐明这些生物现象，我们将提供一个新的技术平台，利用光遗传学的能力比以往更精确地操纵信号转导。
此外，在心肌细胞中，环AMP浓度与心肌收缩力存在密切关系，环AMP环境异常可引起多种类型的心力衰竭。使用 Rh-PDE 的光操纵技术有望阐明心​​脏病的机制并进一步开发治疗方法。

参考图

答：Rh-PDE 蛋白示意图。它的 N 端有一个微生物视紫红质位点，C 端有一个 PDE 位点。 PDE 位点被视紫红质位点的光接收激活并降解环核苷酸。其活性在大约 7 秒内达到最大值。
B：Rh-PDE 蛋白的环 AMP 降解活性。分解活性随着光照射而增加。使用环 GMP 也获得了类似的结果。
C：培养的人类细胞中环AMP浓度的光操纵实验。随着时间的推移，测量表达 Rh-PDE 的 HEK293 细胞中的环 AMP 浓度作为发光强度。环AMP浓度随着蓝绿光照射而降低（红线）。黑线是没有光照射的对照实验。
D：与C相同的实验。当在浅蓝色所示的时间重复光照射时，在很长一段时间内可逆地观察到类似的现象（红线）。黑线是没有光照射的对照实验。

术语表

注1) 环核苷酸
具有环酯键的核苷酸，例如环AMP和环GMP。在细胞内信号传输中充当第二信使（二次信息发射器）。

注2) 光开关离子传输分子
一种掺入细胞膜的蛋白质。当暴露在光线下时，它允许离子通过，改变细胞内外的离子浓度，导致蛋白质功能发生变化。已知的是高度嗜盐细菌所具有的杆视紫质和绿藻所具有的通道视紫红质。

注 3) Choanomonada
一种单细胞生物，长几微米，有一根鞭毛。尽管它们是单细胞生物，但它们在进化上最接近多细胞生物。
　
注4) 视紫红质
光感受器膜蛋白。它作为发色团与视网膜结合，当暴露在光下时，它表现出离子传输等功能。

注释 5) 磷酸二酯酶 (PDE)
环核苷酸水解酶。在人类中，已知有 11 个家族，它们在底物特异性和活性调节机制方面有所不同。

注6) 遗传密码
将DNA碱基序列转换为蛋白质氨基酸序列的代码。

注7) 环AMP、环GMP
环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的缩写（参考：注1）。

注8) HEK293 细胞
人胚胎肾细胞的缩写293。通过用腺病毒E1基因转化人胚胎肾细胞建立的细胞系。易于增殖，易于导入基因，广泛应用于细胞生物学研究。

论文标题

“具有环核苷酸磷酸二酯酶活性的独特领鞭毛虫酶视紫红质”
（来自鞭毛毛虫的具有磷酸二酯酶活性的新型酶型视紫红质）
doi:101074/jbcM117775569

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