开发控制裂殖酵母V体育功能的有机小分子 - 建立指导V体育内蛋白质空间排列的系统 -

大学间研究所法人国立自然科学研究院生命创造探索中心
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演示摘要

　这次，国立自然科学研究院生命创造研究中心（ExCELLS: Excels) / 基础生物学研究所定量生物学研究小组研究员 Akinobu Nakamura、研究员 Hiroki Sugiyama、助理教授 Yuhei Goto、Kazuhiro Aoki 教授、Shinya Tsukiji V体育工学研究生院。该教授的研究小组开发了一种“自定位配体”，一种在裂殖酵母细胞内自发积累（定位）于细胞核和细胞膜中的有机小分子，并开发了一种化学遗传学工具（SLPT系统)建立成功。
　该成果发表在美国学术期刊《''2023年11月22公布日期。

1. 研究背景

裂殖酵母 (粟酒裂殖酵母)是一种真核单V体育生物，其V体育分裂模式与哺乳动物V体育相似，因此被广泛用作阐明各种V体育功能的控制机制的有用模型生物。迄今为止，基因敲除已被用来删除裂殖酵母中的特定基因，以研究这些基因编码的蛋白质与V体育功能之间的关系。然而，基因敲除方法存在致死基因研究困难、时间分辨率低等问题。
首先，该研究小组关注的是V体育内蛋白通过定位于特定的V体育内V体育器（例如V体育核、微管、高尔基体、纺锤体极体等）来精确控制V体育功能。我们相信，如果可以使用小有机分子在任意时间强制改变V体育内蛋白质的定位（定位转变诱导），这将是一种以高时间分辨率控制V体育功能的强大方法。
　迄今为止，使用有机小分子控制V体育内蛋白质定位的传统方法是诱导两种类型蛋白质的二聚化客户ID法律(化学诱导二聚：二聚体诱导化合物）已被报道。但这客户识别码为了在裂殖酵母中使用该方法，存在诸如需要敲除裂殖酵母中的特定基因以及抑制V体育功能等问题。此外，需要表达两个蛋白标签来诱导一种靶蛋白的定位。
　为了解决这些问题，该研究小组致力于开发一种新的有机小分子工具，该工具可以通过单个蛋白标签快速诱导目标蛋白的定位，而不干扰裂殖酵母的V体育功能。

2。研究成果

　该研究小组之前进行过研究^注意1肉豆蔻酸D带有连接半胱氨酸的化合物 (m^Dc基序)自发定位于V体育膜。这个m^Dc基序是源自大肠杆菌的二氢叶酸还原酶 (eDHFR) 的配体TMP)，V体育膜定位TMP（m^DcTMP) 已开发。这个m^DcTMP添加到哺乳动物V体育的培养基中，穿过V体育膜进入V体育质，然后进入高尔基体D半胱氨酸侧链用棕榈酰基进行修饰（棕榈酰化）并通过囊泡运输定位于V体育膜。定位于该V体育膜m^DcTMP至eDHFR,eDHFR的本地化从V体育质到V体育膜。此外，eDHFR^iK6DHFR标签进一步增强了定位到V体育膜的能力。这个研究小组是m^DcTMP自定位配体； SL)，以使用这种自定位配体诱导V体育内蛋白质易位滑动（SL 诱导的蛋白质易位)系统。
　在这项研究中，这种方法是针对哺乳动物V体育开发的滑动我们首先评估该系统是否可以应用于裂殖酵母（图 1A）。首先，我们发现裂殖酵母中半胱氨酸残基的棕榈酰化机制是保守的，并且裂殖酵母TMP专注于不敏感m^DcTMP在裂殖酵母中不抑制V体育功能^iK6DHFR的本地化在V体育膜中。所以实际上^iK6DHFR绿色荧光蛋白mNeonGreen（mNG的人造蛋白质(^iK6DHFR-mNG)的裂殖酵母菌株，并使用共焦激光显微镜对同一视场进行延时成像。m^DcTMP添加前后^iK6DHFR-mNG的V体育内定位的变化m^DcTMP添加之前，^iK6DHFR-mNG扩散到整个V体育，包括V体育核内部，但是m^DcTMP已添加^iK6DHFR-mNG定位于V体育膜。
然而，由于长期成像，这m^DcTMP^iK6DHFR-mNG的质膜定位1〜2发现一段时间后它会分解并返回V体育质。这个研究小组是m^DcTMP的酰胺键被裂殖酵母蛋白酶切割，^iK6DHFR的V体育膜定位已解决，m^DcTMP蛋白酶抗性增加m^DcTMP_4Me（图1B）。这个m^DcTMP_4Me^iK6DHFR-mNG的V体育膜定位12现在可以持续一个多小时（图1c）。此外，一种荧光染料可用作核定位基序赫斯特TMPTMP（锄TMP),^iK6DHFR-mNG的易位从V体育质进入V体育核（图1D、E）。

图 1.针对裂殖酵母进行了优化滑动系统
(A) 使用定位于V体育膜的自定位配体^iK6DHFR诱导融合蛋白从V体育质定位到V体育膜的示意图。
(B)链接器站点4点上的酰胺键N-通过甲基化增加蛋白酶抗性的V体育膜定位TMP（m^DcTMP_4Me)的分子结构。
(C)蛋白酶抗性增强m^DcTMP_4Me^iK6DHFR-mNG的V体育膜定位12可持续一个多小时。
(D)核本地化TMP（锄TMP)的分子结构。(E) 锄TMP^iK6DHFR-mNG的易位从V体育质进入V体育核。

　

　接下来，我们通过将裂殖酵母的内源蛋白定位到V体育膜来控制V体育功能。控制V体育周期进程的重要激酶蛋白CDC2作为第一个目标蛋白，CDC2基因3'最后^iK6DHFR-mNG我们已经建立了一种已引入（敲入）该基因的裂殖酵母菌株。^iK6DHFR-mNG内在性CDC2（CDC2-^iK6DHFR-mNG)定位和V体育周期与野生型菌株几乎相同（图2A，B）。到该V体育系m^DcTMP_4Me已添加CDC2-^iK6DHFR-mNG观察到从V体育核逐渐定位到V体育膜，裂殖酵母的V体育长度变得极长（图）2C，DCDC2定位到V体育膜CDC2的功能受到抑制，V体育周期进程也受到抑制。

图 2SLIPT抑制V体育周期进程A，B）m^DcTMP_4Me延时成像和V体育长度随时间变化而无需。 (C、D）m^DcTMP_4Me添加过程中的延时成像以及V体育长度随时间的变化。

　

此外，其他参与V体育周期进程的内源蛋白^iK6DHFR-mNG敲门16新的V体育系已建立。对于这些V体育系m^DcTMP_4Me，则12使用V体育系^iK6DHFR-mNG我们能够诱导连接蛋白的V体育膜定位。此外，通过持续培养，我们成功诱导了各种表型（V体育形态的变化、V体育死亡等）。另外，m^DcTMP_4Me通过使用延时成像观察添加前后的裂殖酵母，我们成功地以高时间分辨率捕获了导致表型出现的过程。从上述结果来看，m^DcTMP_4Me控制裂殖酵母中内源蛋白定位的方法有望成为控制和分析各种内源蛋白引起的V体育功能的高度通用的工具。

图3. 致死基因spg1的功能滑动以更高的时间分辨率进行观察。 (一)spg1的本地化更改在V体育膜中（左）和spg1的功能被抑制12数小时后V体育表现出更好的形态（右）。 (B)spg1的V体育质/纺锤体极体定位

3. 本研究的问题及未来展望

在这项研究中，我们使用自定位配体研究了裂殖酵母中V体育内蛋白质的定位（m^DcTMP_4Me，锄TMP)以化学方式诱导易位至V体育膜和V体育核滑动系统建立成功。这个滑动通过使用该系统，我们可以定位裂殖酵母中的各种内源蛋白质。1配体・1我们现在已经能够以蛋白质的方式诱导迁移，并且还成功地从内源蛋白质的强制定位开始控制V体育功能。
然而，需要进一步改进以更快地控制蛋白质定位和V体育功能。m^DcTMP_4Me^iK6DHFR-mNG的质膜定位在哺乳动物V体育中5几分钟内完成，但需要使用裂殖酵母30需要几分钟。这可能是因为裂殖酵母是有V体育壁的生物体，分子从V体育外部传递到V体育质需要时间，或者是因为有机小分子被裂殖酵母表达的药物转运蛋白排出体外。为了解决这个问题，m^DcTMP_4Me的V体育壁/V体育膜渗透性。这使得控制以更快的时间尺度进展的V体育功能成为可能，并有望对裂殖酵母中的V体育功能进行更详细的分析。此外，在本研究中，我们将V体育膜和V体育核作为靶V体育器，但原则上也可以通过交换定位基序来靶向其他V体育器。在之前的研究中，该研究小组开发了针对哺乳动物V体育中的微管、高尔基体和内质网等V体育器的定位基序。未来，我们希望优化裂殖酵母的定位基序，并将其开发为通过控制蛋白质定位到各种V体育器来精确控制V体育功能的开/关的基础技术。

注意1）

4。词汇表

电话号码法律：化学诱导二聚方法，利用有机小分子的蛋白质二聚化技术。当添加小分子化合物时，可以在任何时间诱导蛋白质二聚化，从而可以控制蛋白质定位和活性的变化。

图案：小有机分子化合物内具有特定功能的结构。米^Dc基序具有定位于V体育膜的能力。

配体：通过与生物分子结合发挥作用的小分子化合物。

5。出版杂志

期刊名称 ACS Chemical Biology
发布日期2023年份11月22天
论文标题：利用自定位配体诱导的蛋白质易位对裂殖酵母中的内源蛋白质进行化学遗传学操作
作者：Akinobu Nakamura、Yuhei Goto*、Hironori Sugiyama、Shinya Tsukiji、Kazuhiro Aoki*
(*共同通讯作者)
DOI：

6. 研究组

这项研究是与生命创造研究中心/国立基础生物学研究所的 Kazuhiro Aoki 教授小组和V体育的 Shinya Tsukiji 教授合作进行的。

7. 研究支持

这项研究得到了以下资助的支持。
● 日本学术振兴会科学研究补助金/特别研究补助金（19J01341：Akinobu Nakamura）
● 日本学术振兴会青年科学家援助金（19K16050：后藤佑平）
● 日本学术振兴会青年科学家援助金（22K15110：后藤佑平）
● 日本科学技术振兴机构/ACT-X（JPMJAX22B8：后藤佑平）
● 住友财团基础科学研究补助金（后藤佑平）
● 日本学术振兴会科学研究补助金/特别研究补助金（21J01354：Hiroki Sugiyama）
● 日本学术振兴会青年科学家补助金（22K15115：杉山博树）
● NPO酵母V体育研究会吉上吉文纪念研究补助金（杉山博树）
● 日本学术振兴会科学研究资助金/创新领域“分子污染的生物化学”研究（18H04546、20H04706：
　筑地真也)
● 日本学术振兴会科学研究/变革领域研究补助金（A）“支持生物的无V体育分子系统的自下而上”
建筑研究”（21H05226：筑地真也）
● 生命创造研究中心联合使用研究（ExCELLS项目研究）（23EXC601-1：筑地真也，
青木一宏）
● 日本学术振兴会科学研究补助金 (B)（22H02625：Kazuhiro Aoki）
● 日本学术振兴会科学研究/创新领域研究补助金“通过信息物理揭示的生命秩序和设计原理”
（19H05798：青木一宏）
● 日本科学技术振兴机构/CREST（JPMJCR1654：青木一宏）

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