成功开发人工铁载体复合物修饰底物选择性固定化微生物技术-用“人工诱饵”快速检测目标微生物-

演示要点

〇将作为微生物“人工诱饵”的人工铁载体复合物固定在传感器表面
〇微生物细胞表面的蛋白质识别人工铁载体复合物的形状并与其结合
〇：通过调整人工铁载体分子的结构来选择性固定和检测微生物
〇 对于大肠杆菌，无需培养操作即可检测 1 mL 中约 100 个细胞的均匀浓度

摘要

　V体育工学研究科工学部（生物·应用化学）猪又智彦副教授领导的研究小组，成功开发出使用人工铁载体（*1）复合物修饰基质的微生物选择性固定化技术。人工铁载体是模仿天然铁载体的结构和功能的人工分子，与铁离子结合形成复合物。形成的复合物被微生物细胞表面的蛋白质识别并摄入细胞内。换句话说，人工铁载体复合物充当微生物的人工食物。由于可识别的“人工诱饵”的结构根据微生物的种类而不同，因此通过将“人工诱饵”粘合至诸如传感器的基材的表面，可以选择性地固定并检测微生物。在这项研究中，我们准备了四种类型的“人工诱饵”。这些“人工诱饵”被结合到诸如传感器的基底的表面上，并且使用各种微生物来使用各种测量来评估哪些微生物被固定在“人工诱饵”所结合的基底上。结果发现，与传感器结合的“人工诱饵”的结构与固定的微生物类型之间存在相关性。每种微生物都很容易固定在与“人工诱饵”结合的基质表面上，该“人工诱饵”的结构与其使用的天然铁载体相似，并且已经表明，通过调整“人工诱饵”的结构，该技术可以选择性地固定和检测目标微生物。该技术可应用于因引入HACCP（危害分析和关键控制点）（*2）而受到市场强烈需求的大肠菌群快速检测，并将成为“知识中心爱知优先研究项目（第四阶段）（*3）”中正在推进的大肠菌群检测设备开发的基本技术。
》杂志。

研究背景

　微生物产生称为铁载体的螯合分子来吸收铁离子，铁离子是必需的金属离子。铁载体与系统中的铁离子结合形成稳定的复合物。微生物的细胞表面存在识别铁载体和铁离子复合物并将其输入细胞内的蛋白质。不同类型的微生物产生的铁载体的结构不同，识别铁载体与铁离子复合物的蛋白质也不同。人工铁载体是通过简化天然铁载体的结构而设计和合成的具有相同功能的人工分子。人工铁载体还与铁离子形成复合物，并通过蛋白质被微生物吸收。在这项研究中，我们提出了这样的想法：通过应用微生物的生命活动，可以开发一种选择性固定微生物并最终定量检测微生物的技术。

研究内容/结果

　捕获铁离子的铁载体的结构大致可分为两种类型：儿茶酚（*4）型和异羟肟酸（*5）型，但在本研究中，我们设计并合成了两者的混合型，并总共制备了四种类型的人工铁载体分子。将它们与铁离子结合的复合物结合到各种基质表面，并使用电子显微镜、石英晶体微天平法和交流阻抗法观察八种微生物的选择性固定行为。
　图1是使用电子显微镜确认与各人工铁载体复合体结合的固定在基材表面上的各微生物的量的结果。根据微生物种类的不同，易于固定的人工铁载体复合物的结构也有所不同。微生物利用细胞表面的蛋白质识别人工铁载体和铁离子复合物的结构，并将其整合到细胞中。然而，由于微生物物种产生的铁载体的结构和识别它们的蛋白质不同，因此可以识别的铁载体复合物的结构也不同。我们的结果表明，微生物最好固定在与每种微生物产生的天然铁载体结构相似的人工铁载体复合物结合的基质表面上，即每种微生物的蛋白质以结合方式与基质上存在的可识别的人工铁载体复合物相互作用。

图1　使用与 4 种人工铁载体复合物结合的底物的各种微生物
固定化实验（有关所用人工铁载体复合物的结构，请参阅概述图）。

　

　图2是使用石英晶体微量天平法的微生物固定化实验的测量结果。晶体振荡器以恒定频率振动，但当物质吸附到表面时，频率会根据吸附量而降低。晶体振荡器微天平法应用这一原理来测量物质对传感器表面的吸附和结合作为重量的变化。使用石英晶体传感器结合四种类型的人工铁载体复合物时，可以识别异羟肟酸类型的微生物（M。苦参)，异羟肟酸型(FeL_H3/Au)和含有大量异羟肟酸型(FeL_C1H2/Au) 固定在粘合的传感器表面上，观察到较大的频率下降。另一方面，可以识别儿茶酚类型的微生物（大肠杆菌，E。大肠杆菌)，儿茶酚型(FeL_C3/Au) 和含有多种儿茶酚类型的混合型 (FeL_C2H1/Au)被固定在粘合的传感器表面上，并且频率大大降低。这些结果表明，可以通过观察频率变化来确认微生物的选择性固定化。

图2　使用与四种类型的人工铁载体复合物结合的石英晶体传感器进行微生物固定实验。

　

　交流阻抗法通过向电极施加交流电压，可以获得电极界面、内阻等各种信息。它还用于熟悉的应用，例如体脂秤。在本研究中，我们使用了与人工铁载体复合物结合的电极，发现当微生物固定在电极表面的人工铁载体复合物上时，电阻值根据固定微生物的量而变化。利用它，可以定量检测微生物。使用实际大肠杆菌的实验结果图3所示，当大肠杆菌浓度为100～1亿个/mL时，观察到的电阻值与大肠杆菌浓度呈线性关系，表明可以对大肠杆菌进行定量检测。

图3　交流阻抗法测得的电阻变化与样品中大肠杆菌浓度的关系。

社会意义/未来展望

　随着2021年实施的食品卫生法修订，引入了符合国际标准HACCP的卫生管理。尽管也有一些例外，但由于法律改革，几乎所有食品制造商都被要求实施符合 HACCP 的卫生管理，并且市场对快速简便的微生物检测的需求不断增长，特别是能够检测大肠菌等特定微生物群的技术。在大多数情况下，当前的大肠杆菌测量技术需要培养操作或只能检测特定类型的大肠杆菌。该技术还可应用于无需培养操​​作即可定量、高灵敏度测量多种不同大肠杆菌的技术。

　这项研究成果是爱知县的一个项目，由V体育和土屋株式会社在科学技术交流基金会管理和实施的“知识中心爱知县优先研究项目第四期”中进行。这是KI正在推动的“大肠菌群检测技术与设备开发”的基础技术种子。化成株式会社和北村材料研究所，通过这个项目，我们正在开发新的大肠菌群测量技术和设备。

术语表

※1铁载体
一种由微生物产生的天然螯合分子，可将铁离子带入细胞，其名称来源于希腊语“sidero”，意思是铁，“-phore”意思是转运蛋白。模仿天然铁载体的结构和功能的人工分子称为人工铁载体。

※2 HACCP（危害分析和关键控制点）
产品制造商自行识别食物中毒细菌污染、异物污染等危害，然后管理特别重要的工序以确保安全，以消除或减少从原材料接收到产品运输的整个过程中的危害的管理方法。

※3知识库爱知优先研究项目
这是一个产学官合作研发项目，旨在解决该县主要产业面临的问题，开发和商业化新技术，并通过利用大学和其他机构的研究种子的开放式创新提供新服务。该项目由公益财团法人科学技术交流基金会受爱知县委托实施。

※4 儿茶酚
苯酚的一种，一种在苯环的邻位（相邻碳原子上）含有两个羟基（-OH）结构的有机化合物。

※5异羟肟酸
结构通式为R-C(=O)-NH-OH的有机化合物的总称。N-也称为羟基羧酸酰胺。

论文信息

论文标题：使用人工铁载体-FeIII复合物修饰底物检测微生物
作者姓名：Tomohiko Inomata、Suguru Endo、Hiroki Ido、Masakazu Miyamoto、Hiroki Ichikawa、Ririka Sugita、Tomohiro Ozawa 和 Hideki Masuda
出版杂志名称：Langmuir
发布日期：2024/1/22
DOI:101021/acslangmuir3c03084
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猪又智彦副教授
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