阐明非经典通道V体育官网红质 GtCCR4 的高灵敏感光机制

东京大学
V体育

演示要点

◆源自隐藻的通道V体育官网红质GtCCR2和GtCCR4的结构分析GtCCR4独特的新结构
◆GtCCR2 和GtCCR4GtCCR4具有独特的结构，无需通道恢复时间并实现高灵敏度感光。
◆GtCCR4光遗传学特性的综合评价和高活性突变体的创建GtCCR4光遗传学工具和基因治疗药物。

GtCCR2和GtCCR4的冷冻电镜图

摘要

　此次，东京大学研究生院理科研究生院努雷木修教授领导的研究小组与V体育生命与应用化学系特聘教授神取秀树领导的研究小组正在进行视紫红质通道蛋白的联合研究（注）。1)GtCCR2和GtCCR4冷冻电镜）(注意2)进行单粒子分析（注意3）。
GtCCR 是2016隐藻于 2017 年首次报道（注）4)。这个GtCCR是绿藻（注5)-2为代表6)在进化上与细菌V体育官网红质（一种质子泵）相距甚远。7) 相同的基序。其中GtCCR4是GtCCR1-3或V体育官网红质通道-2比较10一种新颖的光遗传学工具，光敏度提高两倍以上（注）8）和盲人患者的基因治疗药物（注9）。但如何GtCCR4的详细机制实现高灵敏度感光效果尚不清楚。
　这次，使用冷冻电子显微镜GtCCR2和GtCCR4的结构确定并进一步进行电生理实验（注10)，光谱实验（注11)GtCCR4的高灵敏感光机制GtCCR4就是那个6th 跨膜螺旋中的大弯曲通过忽略激活时蛋白质骨架的结构变化并消除从通道关闭到再次接收光的恢复时间的需要，从而实现高度灵敏的光接收。另外，GtCCR4光遗传学特性的综合评价并创建高活性突变体GtCCR4的进一步潜力作为光遗传学工具。这项研究的结果预计将有助于开发新的高灵敏度光遗传学工具和色素性视网膜炎的基因治疗药物。

演示内容

研究背景

　通道V体育官网红质是一种微生物V体育官网红质，它接收光并打开通道以允许各种离子通过。2005V体育官网红质-2控制神经放电据报道，V体育官网红质通道蛋白已被广泛研究并用作光遗传学工具。此外，V体育官网红质通道蛋白也正在被研究作为一种治疗无法治愈的遗传性疾病色素性视网膜炎的基因治疗药物，并且有报道称，在因色素性视网膜炎而丧失视力的患者的视网膜中表达V体育官网红质通道可以部分恢复他们的视力。
GtCCR 是2016源自隐藻的V体育官网红质通道蛋白，首次报道于 这个GtCCR是源自绿藻的V体育官网红质通道蛋白-2代表的经典通道V体育官网红质相差甚远，但与质子泵细菌V体育官网红质具有相同的基序，因此也称为细菌V体育官网红质样通道V体育官网红质。其中GtCCR4是GtCCR1-3或V体育官网红质通道-2的10它具有两倍以上的光敏性，已被研究作为下一代光遗传学工具和基因治疗药物。但是GtCCR4实现高灵敏度的感光。所以，同样GtCCR家庭蛋白质GtCCR2和GtCCR4的结构，进行进一步的功能分析并比较结果GtCCR4的高灵敏感光机制。

研究内容和结果

　在这项研究中，通过使用冷冻电子显微镜的单颗粒分析方法GtCCR2和GtCCR427 埃（图1）。GtCCR2和GtCCR4是细菌V体育官网红质和其他细菌V体育官网红质样通道V体育官网红质ChRmine等等。

图1：GtCCR2和GtCCR4的三聚体(左)和单一（右）结构

　

令人惊讶的是，GtCCR4的6第一个跨膜螺旋是GtCCR2或V体育官网红质通道-2相比，它具有大大弯曲的结构。等等（图2）。到目前为止，当微生物V体育官网红质被激活TM6基态微生物V体育官网红质TM6弯曲。

图2：GtCCR2和GtCCR4的TM6的比较

　

　接下来，为了研究这种结构对光反应时间常数的影响，我们使用闪光激光进行了电生理学实验和时间分辨光谱实验。通过闪光激光GtCCR2和GtCCR4被激发，通道关闭时间由电流的衰减确定，通道恢复时间由中间体吸收的衰减和吸收返回基态确定。GtCCR2频道关闭时间408 毫秒，通道恢复时间118 毫秒大约24466_24501|从通道关闭到再次接受光线为止7 毫秒我发现需要一段时间（图3左）。相比之下GtCCR4频道关闭时间209 毫秒，通道恢复时间195 毫秒，并且发现通道关闭后几乎立即返回到基态并再次能够接收光（图3右）。

图3：GtCCR2和GtCCR4光循环中的时间常数

　

另外，通过低温红外光谱实验GtCCR2和GtCCR4后肽主链发生变化。一般来说，在蛋白质的红外吸收光谱中，1650 厘米^-1附近的峰值（酰胺 I 带）反映二级结构的变化。GtCCRK中间体和M人们认为中间体之间发生了结构变化，比较这些光谱表明GtCCR4是GtCCR2相比几乎没有看到任何变化（图4）。从现在开始GtCCR4激活后结构发生微小变化。

图4：GtCCR2和GtCCR4的低温红外光谱

　

　根据这些结构分析、电生理学实验和光谱实验获得的结果，GtCCR4在基态下大大弯曲6第跨膜区(TM6)，可以通过省略伴随激活的蛋白质骨架的结构变化来实现高灵敏度的光接收，并且消除从通道关闭到再次接收光的恢复时间的需要（图5）。此前已有研究表明，通道关闭时间与光敏度之间存在正相关关系。GtCCR4具有高光敏性，无法用通道关闭时间的长短来解释。这一结果表明V体育官网红质通道的动力学是由一种新颖的结构控制的，同时也揭示了光敏性的一个新因素：通道恢复时间。

图5：GtCCR2和GtCCR4的光激活模型

　

最后，该研究小组开发出了V体育官网红质，其详细特性已得到阐明ChRmine作为对照，GtCCR4的光遗传学特性比较这些连续和间歇性长期刺激的光电流，GtCCR4失活ChRmine小，照射开始时的电流几乎维持到照射结束（图）6左）。此外，我们使用来自大鼠大脑皮层的原代培养神经元通过间歇性光刺激测量神经放电。ChRmine中，光同步射击的成功率约为61虽然是%GtCCR4是关于91%（图6右）。这些结果是GtCCR4不仅对光高度敏感，而且还是一种高度可靠的工具。此外，在本研究中，我们根据氨基酸序列进行了筛选，并与野生型进行了比较。3表现出两倍的光电流GtCCR4GtCCR4有望作为光遗传学工具和基因治疗药物应用。

图6：GtCCR4和ChRmine

　

　该研究结果将为理解微生物V体育官网红质的结构和动力学提供重要线索，并有望为开发新型高灵敏光遗传学工具和盲人患者基因治疗药物做出巨大贡献。

演讲者/研究人员信息

东京大学研究生院生物科学系
田中达希特聘助理教授
饭田涉博士
佐野文也博士课程
　　　　小田一正：博士生（研究时）
志保谷涉，助理教授
　　　　　　Nureki教授

V体育
工程研究生院
Yoshi Yamashita 硕士课程（研究时）
重村修太硕士课程（研究时）
中村俊树硕士课程
杉本彻平博士课程

　生命科学与应用化学
特聘助理教授细岛能子
片山浩大副教授
古谷雄二副教授
角田聪特聘副教授
　神取秀树特别教授

名古屋大学研究生院理学部
内桥孝之教授

论文信息

杂志名称：Molecular Cell
标题：细菌V体育官网红质样通道V体育官网红质 GtCCR4 的高光敏机制和光遗传学特性
作者姓名：Tatsuki Tanaka、Shoko Hososhima、Yo Yamashita、Teppei Sugimoto、Toshiki Nakamura、Shunta Shigemura、Wataru Iida、Fumiya K Sano、Kazumasa Oda、Takayuki Uchihashi、Kota Katayama、Yuji Furutani、Satoshi P Tsunoda、Wataru Shihoya*、Hideki神取*、努雷木修*。
(*共同通讯作者)
DOI：101016/jmolcel202408016
网址：

研究补助金

这项研究是日本学术振兴会科学研究补助金的基础S``在生物环境中GPCR的结构动力学” （首席研究员：Osamu Nureki）和基金会B“使用冷冻电子显微镜GPCR药物发现研究”（研究代表：Shihoya Wataru），创新学术领域研究“光活性蛋白的时间分辨结构分析和合理修饰”，特别推广研究“阐明支持光遗传学的V体育官网红质的操作机制”（研究代表：神取秀树），文部科学省跨学科中心形成计划“多尺度”量子经典生命界面研究联盟”，第一三共株式会社TaNeDS这是作为计划的一部分完成的。此外，本研究AMED作为“药物发现和其他生命科学研究支撑基础设施项目”和“创新型先进研究开发支撑项目孵化型”的一部分，“药物发现和其他先进技术支撑基础设施平台”旨在通过对外开放同步辐射设施等大型设施，将优秀的生命科学研究成果与药品的实际应用联系起来。绑定)的支持。

术语表

（注意1)V体育官网红质通道
一种微生物V体育官网红质，由具有七个跨膜螺旋的视蛋白和发色团视网膜组成。它通过接受光和打开通道来被动传输离子。迄今为止，已经发现了具有各种性质的通道V体育官网红质，包括渗透阳离子的通道V体育官网红质、渗透阴离子的通道V体育官网红质以及选择性地渗透阳离子中的一价金属离子的通道V体育官网红质。

（注意2) 冷冻电子显微镜
液氮(-196℃) 一种通过在冷却下用电子束照射蛋白质等分子来观察样品的装置。它用于单粒子分析，通过拍摄蛋白质和核酸等生物聚合物的多个图像来确定它们的三维结构。

（注意3）单粒子分析
对大量均匀颗粒进行观察和拍照，通过图像处理获得颗粒详细结构的方法。除了与单个捕获图像相比提高分辨率之外，通过捕获面向各个方向的粒子，3可以掌握维度结构。

（注意4) 隐藻
主要包括隐藻纲隐藻纲的单细胞藻类的总称。大多数真核生物2它有鞭毛并表现出趋光性。

（注意5）绿藻
虽然它有时指整个藻类，但这里它用作绿藻门中藻类的总称。它们是真核生物，包括多种物种，从单细胞到群体再到多细胞。V体育官网质通道-2是一种单细胞生物，有鞭毛。

（注意6) 经典通道V体育官网红质
V体育官网红质通道蛋白，此处确定的第一个V体育官网红质通道蛋白-1和V体育官网红质通道-2主要形成同型二聚体。

（注意7) 细菌V体育官网红质
高度嗜盐细菌拥有的V体育官网红质家族蛋白，它是一种质子泵，可利用光能主动将氢离子向外（细胞外）运输。它是第一个被发现的微生物V体育官网红质，也是第一个确定其结构的微生物V体育官网红质，并被用作模型蛋白质。

（注意8）光遗传学
一种通过将光响应蛋白基因引入个体中来利用光控制生命活动的方法。特别地，将V体育官网质通道引入神经细胞并利用光使阳离子流动以引起神经放电的方法被广泛用于神经细胞的功能分析。其他已知的方法包括通过在神经细胞中表达内向阴离子泵V体育官网红质来抑制神经放电。

（注意9）基因治疗
一种旨在通过使用病毒载体将特定基因引入患者细胞来改善疾病状态的治疗方法。为了用V体育官网红质通道蛋白治疗失明，将V体育官网红质通道蛋白引入视神经，导致视神经响应光而放电，模拟健康状态下的信号传输。

（注意10）电生理实验
一种通过将电极固定到细胞表面并测量电流来观察由于离子通道和离子泵而产生的细胞内外离子流动的方法。在本研究中，不仅通过一般的稳定光照射进行测量，还通过激光照射进行测量。

（注意11）光谱实验
一种通过测量物质吸收和发射的光谱来研究物质结构的方法。本研究采用了可见光区的时间分辨吸收光谱和低温吸收光谱，以及红外区的低温吸收光谱。

联系信息

研究相关

东京大学研究生院生物科学系
Osamu Nureki 教授
电话：03-5841-4394
电子邮件：nureki[at]bssu-tokyoacjp

V体育生命与应用化学系
特聘教授神取英树
电话：052-735-5207
电子邮件：kandori[at]nitechacjp

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