利用振动光谱法开发药效测量方法 - 对开发针对乙酰胆碱受体的神经系统疾病治疗药物的期望 -

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京都大学

演示要点

〇全内反射红外光谱^（注1)毒蕈碱乙酰胆碱受体^（注2)适用不同药物功效^（注3)
〇酰胺类与各种药物的功效相关-I^(注意4)的波段变化，并且在cell中发现了这个变化G发现它反映了蛋白质活性。
〇​这项研究将有助于开发针对毒蕈碱乙酰胆碱受体的药物发现，并将有助于了解药物识别的分子机制。

摘要

　V体育工学研究科助理教授 Kodai Katayama、Hideki Kandori 教授和 Shuhei Shu 先生(研究时：生命与应用化学系，硕士课程2年)，由关西医科大学医学院医学化学系教授Takuya Shimizu（Kobayashi）、讲师Ryoji Hisano、东北大学药学研究生院Asuka Inoue副教授和京都大学医学研究生院So Iwata教授组成的小组利用全内反射红外光谱进行了研究G蛋白质偶联受体(GPCR)毒蕈碱乙酰胆碱受体(M₂R)（配体功效）(图1)和每个红外差异光谱^（注意5)-I我们发现了根据谱带变化对各种药物进行分类的可能性。事实上，使用细胞测定G蛋白质活性和酰胺的大小-I我们发现波段变化之间存在相关性。作为本研究的结果，通过全内反射红外光谱法获得了酰胺-IM₂R配体功效的探针外，还有望提出新的药物设计指南，通过从相互作用分析中提取动态结构信息来控制药物功效，这与基于结构的药物结合口袋的传统药物设计指南不同。

研究结果是2021年11月23在线科学杂志'通讯生物学》杂志。

图1 从溶液循环全内反射红外光谱中获得M₂R的差异光谱

研究背景

G蛋白偶联受体（G 蛋白偶联受体：GPCR）是由药物结合等引起的结构变化(激活)是传输到细胞中的信号转导因子(G蛋白质/逮捕)发出信号(图2a)。GPCR由于其生物活性，该药物是一种完全激动剂（完全激动剂），一种部分激动剂，即使施用饱和剂量的药物也仅显示部分活性（部分激动剂），基础活动(药物未结合GPCR有一定的弱活性)（对手）以及甚至抑制基础活性的反向激动剂（反向激动剂）(图2b)这些药物的功效有何不同？“配体功效”称为22067_22092|，影响药效，所以要看每种药物功效的分子机制差异将有利于合理的药物开发。到目前为止一些GPCR不同之处功效X原子水平的结构已通过使用线晶体衍射和冷冻电子显微镜的单粒子分析确定。然而，并非所有药物，例如药物亲和力低的天然药物或部分激动剂，都可以应用于这些结构分析方法，世界各地的结构生物学家仍在努力解决这一问题。

图2 (a)GPCR药物结合和激活过程(b)药效差异（配体功效）

研究内容/结果

　本课题组自主研发了全内反射红外光谱法2使用结合液体交换系统的测量方法GPCR毒蕈碱乙酰胆碱受体(M₂R)到，不同功效结合相关的结构变化。结果，在获得的各种药物结合诱导的差异光谱中，α-螺旋C=O对应于伸缩振动带的酰胺-I我们发现带变化可以在各种配体之间进行分类的可能性(图3)。即观察到3两个酰胺-I每个波段①、②和③的峰强度总和(①＋②、②＋③)每个M₂R的活动状态和非活动状态G计算蛋白质激活程度的结果，配体功效（图3）。
此外，每种药物均使用培养细胞G蛋白质活性评估（NanoBit G 蛋白解离测定）^(注意6)G蛋白质活性的大小位于纵轴上，通过红外光谱获得G将蛋白质活化度值绘制在横轴上，结果发现存在相关性(图4)换句话说，该结果与通过全内反射红外光谱法得到的酰胺-I的波段变化M₂R的配体功效的探针。

图3（a、b、c）氨基-I来自乐队G蛋白质活化程度定量分析

　

图4 氨基-I从乐队获得G蛋白质活化程度与使用细胞NanoBiT G从蛋白质测定中获得G蛋白质活化度图

社会意义/未来前景

已经在这项研究中X使用冷冻电子显微镜进行原子级线晶体结构分析和单粒子分析GPCR的固定结构已获得GPCR，通过将其与从红外光谱获得的分子间相互作用的详细结构信息相结合GPCR的配体选择性和激活机制。此外，预计我们将能够提出新的药物设计指南，通过从相互作用分析中提取动态结构信息来控制信号选择性和药物功效，这与基于结构的药物结合袋的传统药物设计指南不同。特别是乙酰胆碱受体5类型子类型(M₁R来自M₅R)存在M₁R主要存在于大脑中，参与记忆和学习，是本研究的主题M₂R心脏中含量丰富，各亚型接受相同的神经递质乙酰胆碱，但有其独特的分布和药理作用。因此，这项研究有望为亚型选择性药物发现研究做出贡献。另外，本次建立的测量方法是GPCR引起关注的膜蛋白以及其他药物靶点(离子通道和转运蛋白)

术语表

注1 全内反射红外光谱
使用由折射率高于样品的硅或金刚石等材料制成的晶体，将样品吸附在其表面上，红外线以在晶体内部引起全内反射的角度入射。此时，在红外反射面处渗出到晶体表面的近场光（倏逝光）被存在于表面附近的样品吸收。由于倏逝光仅在红外光波长（3 至 10 μm）处穿透表面，因此可以仅测量表面附近的红外吸收。另一个优点是可以使用相对少量的样品（大约 1 至 5 μg）进行测量。

注2毒蕈碱乙酰胆碱受体
GPCR 之一，它是一种膜蛋白，接受乙酰胆碱（一种与帕金森病和阿尔茨海默病有关的神经递质）作为天然配体。5类型子类型(M₁R来自M₅R)存在并且是本研究的主题M₂R主要分布于心脏，以抑制方式调节心脏功能。

注3药物功效
GPCR 药物根据其生物活性分为完全激动剂、即使施用饱和剂量的药物也仅显示部分活性的部分激动剂、不改变基础活性的抑制剂（未结合药物的 GPCR 表现出持续弱的活性）以及甚至抑制基础活性的反向激动剂。这些药物功效的差异称为“配体功效”。

注释 4 酰胺-I
构成蛋白质二级结构的α-螺旋肽键C=O拉伸振动“酰胺-I它被称为“乐队”。一般来说1650 厘米-1附近有红外吸收

注5红外差谱
指的是非药物结合状态和药物结合状态的红外光谱相减得到的光谱。由于药物结合而产生的样品（蛋白质）结构变化产生的红外吸收带被检测为差异光谱。

注6 G蛋白活性测定（NanoBiT G蛋白解离测定）
一种检测活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法。修饰发光蛋白荧光素酶及其底物以产生两者的片段(LgBiT和SmBiT)检测细胞内蛋白质的相互作用。G具有α亚基G每个γ亚基LgBiT和SmBiT在细胞中融合并表达形成三聚体G蛋白质激活(解离反应)被检测为发光信号的减少。

论文信息

论文标题：人 M2 毒蕈碱乙酰胆碱受体 (M2R) 配体功效的振动光谱分析
作者姓名：Kota Katayama、Kohei Suzuki、Ryoji Suno、Ryoji Kise、Hirokazu Tsujimoto、So Iwata、Asuka Inoue、Takuya Kobayashi、Hideki Kandori
出版期刊名称：Communications Biology
发布日期：2021 年 11 月 23 日
DOI：101038/s42003-021-02836-1
网址：

　

此研究结果基于日本科学技术振兴机构 (日本标准时间) 战略性创意研究推进项目PRESTO“应用量子技术创建生命科学基础设施”研究领域研究题目：“基于结构基础阐明颜色识别机制和色视觉信息传递机制”（摩根大通JPR19G4）2019 年采用(研究员：Kodai Katayama) 以及日本学术振兴会科学研究资助金的年轻研究人员(首席研究员：片山浩大)，基础研究(B) (首席研究员：片山浩大)，基础研究(A) (首席研究员：神取秀树)，新学术领域研究(研究领域提案类型) (首席研究员：神取英树)，基础研究(C) (首席研究员：久野亮司)，基础研究(B) (首席研究员：久野亮司)，学术转型领域研究(B) (首席研究员：久野亮司)，新学术领域研究(研究领域提案类型) (首席研究员：岩田壮介) 与学术转型领域研究(B) (首席研究员：井上明日香) 的一部分完成的此外，这项研究是由日本医学研究开发机构（国家研究开发机构）进行的(AMED)“药物发现等生命科学研究支撑平台”和“药物发现等先进技术支撑平台”（绑定）的支持。

联系信息

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电子邮件：katayamakota[at]nitechacjp

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